As estratégias tradicionais de diagnóstico para detectar doenças infecciosas exigem o uso de instrumentos de bancada que não são adequados para testes no local de atendimento (POCT).A microfluídica emergente é uma tecnologia altamente miniaturizada, automatizada e integrada que é uma alternativa potencial aos métodos tradicionais para diagnósticos no local rápidos, de baixo custo e precisos.Os métodos de diagnóstico molecular são amplamente utilizados em dispositivos microfluídicos como os métodos mais eficazes para detecção de patógenos.Esta revisão resume os avanços recentes no diagnóstico molecular baseado em microfluídicos de doenças infecciosas de uma perspectiva acadêmica e industrial.Primeiro, descrevemos um processamento típico no chip de ácidos nucleicos, incluindo pré-tratamento de amostra, amplificação e leitura de sinal.As características, vantagens e desvantagens dos quatro tipos de plataformas microfluídicas são então comparadas.A seguir, discutiremos o uso de ensaios digitais para a quantificação absoluta de ácidos nucleicos.Os dispositivos de diagnóstico molecular baseados em microfluídicos comerciais clássicos e recentes são resumidos como evidência do estado atual do mercado.Por fim, propomos direções futuras para o diagnóstico microfluídico de doenças infecciosas.
As doenças infecciosas são causadas por patógenos, incluindo bactérias, vírus e parasitas, que estão distribuídos por todo o mundo.Ao contrário de outras doenças, os patógenos rapidamente se infectam e se espalham entre humanos e animais hospedeiros por meio de inoculação, ar e água [1].A prevenção de doenças infecciosas é fundamental como medida de saúde pública.Três estratégias principais de combate às doenças infecciosas: (1) controlar a fonte de infecção;(2) interrupção do trajeto de transmissão;(3) proteção de populações suscetíveis.Dentre as principais estratégias, o controle da fonte de infecção é considerada a estratégia mais importante devido à sua praticidade e baixo custo.O diagnóstico rápido, isolamento e tratamento de indivíduos infectados são críticos, exigindo estratégias de diagnóstico rápidas, sensíveis e precisas [2].O diagnóstico atual de doenças infecciosas geralmente combina exame clínico baseado em sinais e sintomas e estudos laboratoriais, como cultura de células e diagnóstico molecular, que exigem pessoal treinado, procedimentos de trabalho intensivo e equipamentos de teste caros [3, 4].A prevenção de surtos de doenças infecciosas requer um diagnóstico local rápido, barato e preciso, especialmente em áreas com recursos limitados onde as doenças infecciosas são comuns e graves [5], bem como o tratamento no deserto ou no campo de batalha, onde as emergências são imprevisíveis..os cuidados médicos são limitados [6].Nesse contexto, a microfluídica é uma tecnologia que combina tecnologias de sistemas microeletromecânicos, nanotecnologia ou ciência de materiais para manipulação precisa de fluidos [7,8,9,10], proporcionando novas possibilidades para detecção no ponto de atendimento (POCT).) agentes infecciosos fora de hospitais e laboratórios.Em comparação com os diagnósticos tradicionais, demorados, a tecnologia microfluídica oferece economia de amostras e custos para diagnóstico molecular durante surtos de doenças.A disseminação global da doença de coronavírus 2019 (COVID-19) é causada pela síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2), portanto, a importância da microfluídica para a prevenção e controle oportunos da pandemia é novamente enfatizada [11, 12 , 13].Ao contrário do diagnóstico tradicional, o POCT microfluídico usa pequenos dispositivos portáteis que variam de analisadores de bancada a pequenas tiras de teste de fluxo lateral para testar perto do ponto de amostragem [14].Esses testes apresentam preparação simplista ou nenhuma amostra, amplificação rápida de sinal e leituras de sinal sensíveis, resultando em resultados de curta duração e precisos em minutos.A disponibilidade e a produção em massa de instrumentos de saúde baseados em microfluidos expandiram suas aplicações de diagnóstico direto e econômico fora do hospital, perto do paciente e até mesmo em casa.
Dentre as estratégias existentes para o diagnóstico de doenças infecciosas, o diagnóstico molecular é uma das mais sensíveis [15, 16].Além disso, o diagnóstico molecular é frequentemente usado como padrão-ouro para detecção contínua de COVID-19, permitindo a detecção direta de regiões específicas de vírus de RNA ou DNA antes do início de uma resposta imune [17, 18].Na revisão atual, apresentamos os mais recentes avanços em processos de diagnóstico molecular baseados em microfluídica para doenças infecciosas, desde uma perspectiva acadêmica até perspectivas industriais futuras (Fig. 1).Começaremos com três etapas principais na detecção de ácido nucleico: pré-tratamento de amostra no chip, amplificação de ácido nucleico e leitura de sinal.Em seguida, comparamos diferentes tipos de plataformas microfluídicas com sua estrutura e função, mostrando características únicas (pontos fortes e fracos).A detecção de ácido nucleico digital é discutida e apresentada como um exemplo de uma tecnologia de terceira geração para a quantificação absoluta de moléculas de patógenos infecciosos.Além disso, vários dispositivos POCT comerciais típicos e mais recentes serão apresentados para demonstrar o estado atual do mercado POCT microfluídico para diagnóstico molecular.Também discutiremos e explicaremos nossa visão para aplicações futuras.
Os módulos de chips microfluídicos para detecção de ácidos nucleicos podem ser divididos em três categorias (amostragem, reconhecimento e sinalização) de acordo com suas funções [19].Entre esses módulos, o módulo de amostragem realiza principalmente lise de amostra e extração de ácido nucleico.O módulo sensor controla principalmente a conversão e amplificação de sinais de ácido nucleico.O módulo de sinalização detecta o sinal convertido e processado pelo módulo de detecção.Com base no processo de detecção de ácidos nucleicos em um chip, resumiremos os vários chips que podem realizar a função de “entrada e saída”.
O primeiro passo na detecção de ácido nucleico é a extração de ácido nucleico, ou seja, isolando o ácido nucleico alvo da amostra original.A extração de ácido nucleico é realizada para purificar os ácidos nucleicos de outros contaminantes moleculares, garantir a integridade da estrutura primária das moléculas de ácido nucleico e otimizar os resultados.A extração de ácido nucleico requer a necessária lise de amostra e captura de ácido nucleico, cuja qualidade e eficiência têm um enorme impacto nos resultados de pesquisa e diagnóstico.Quaisquer efeitos colaterais sutis durante a extração podem limitar a detecção adicional.Por exemplo, os métodos de reação em cadeia da polimerase (PCR) e amplificação isotérmica em alça (LAMP) são inibidos por alguns solventes orgânicos residuais, como etanol e isopropanol, em reagentes de isolamento de ácido nucleico [20].A extração líquido-líquido e a extração em fase sólida são os métodos mais populares para o isolamento de ácidos nucleicos [21], no entanto, a extração líquido-líquido em um chip é extremamente limitada, uma vez que os reagentes usados na extração líquido-líquido causam corrosão da maioria dos chips microfluídicos .Aqui, destacamos os métodos de extração em fase sólida baseados em microarrays e comparamos suas vantagens e desvantagens.
O silício é um material de substrato compatível com ácidos nucleicos devido à sua biocompatibilidade, estabilidade e facilidade de modificação [22].É importante ressaltar que, quando modificado com sílica ou outros materiais, este compósito exibe propriedades para adsorver ácidos nucleicos carregados negativamente sob condições de baixo pH e alto teor de sal enquanto elui com alto pH e soluções de baixo sal.Com base nesse fenômeno, é possível purificar o ácido nucleico.
Várias formas de materiais à base de sílica têm sido usadas para extração de ácido nucleico em microfluídica, como grânulos de sílica, pós, filtros de microfibra e membranas de sílica [23, 24, 25, 26].Dependendo das propriedades do material, materiais à base de silício podem ser usados em microcircuitos de diferentes maneiras.Por exemplo, grânulos de sílica, pós e nanofiltros comerciais podem simplesmente ser colocados nos poros ou microcanais de chips microfluídicos e ajudar a extrair ácidos nucleicos de amostras [27, 28, 29].As membranas de sílica modificadas na superfície também podem ser usadas para purificar rapidamente o DNA de patógenos a baixo custo.Por exemplo, Wang et al.[30] Ao combinar reações de amplificação desnaturantes com troca de cadeia mediada por vesículas com membranas de sílica revestidas com oligossacarídeos de quitosana, um sistema portátil versátil foi introduzido que detectou com sucesso 102-108 unidades formadoras de colônias.(UFC)/ml Vibrio parahaemolyticus., e a presença do vírus era facilmente visível.Powell et ai.[31] Microarrays à base de silício foram então usados para detectar o vírus da hepatite C (HCV), vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus Zika e papilomavírus humano e propagação automática, na qual um microrreator tortuoso de 1,3 μl foi desenvolvido para capturar vírus de RNA.e realizar a amplificação in situ.Além desses métodos, as microcolunas de sílica modificadas na superfície também desempenham um papel fundamental na extração de ácido nucleico, pois a geometria e as propriedades do material modificador aumentam muito a eficiência da extração.Chen et ai.[32] propuseram uma plataforma microfluídica para isolamento de RNA de baixa concentração com base em microcolunas de silício revestidas com amino.Este dispositivo microfluídico integra uma matriz de micropilares de 0,25 cm2 em um substrato de silício para obter maior eficiência de extração por meio de um design de alta área de superfície em relação ao volume.A vantagem deste projeto é que o dispositivo microfluídico pode atingir até 95% de eficiência de extração de ácido nucleico.Essas estratégias baseadas em silício demonstram o valor do isolamento rápido de ácidos nucleicos a baixo custo.Em combinação com chips microfluídicos, as estratégias de extração à base de silício podem não apenas aumentar a eficiência da detecção de ácidos nucleicos, mas também facilitar a miniaturização e integração de dispositivos analíticos [20].
Os métodos de separação magnética usam partículas magnéticas para isolar ácidos nucleicos na presença de um campo magnético externo.As partículas magnéticas comumente usadas incluem partículas magnéticas Fe3O4 ou γ-Fe2O3 revestidas com sílica, amino e carboxila [33,34,35,36].A característica distintiva das partículas magnéticas em comparação com os métodos SPE baseados em silício é a facilidade de manipulação e controle com ímãs externos.
Usando a interação eletrostática entre ácidos nucléicos e sílica, sob condições de alto teor de sal e baixo pH, os ácidos nucléicos são adsorvidos na superfície das partículas magnéticas revestidas de sílica, enquanto sob condições de baixo sal e alto pH, as moléculas podem ser lavadas novamente..Grânulos magnéticos revestidos de sílica tornam possível extrair DNA de amostras de grande volume (400 μL) usando movimento controlado magneticamente [37].Como demonstração, Rodriguez-Mateos et al.[38] usaram ímãs sintonizáveis para controlar a transferência de esferas magnéticas para diferentes câmaras.Com base em partículas magnéticas revestidas de sílica, 470 cópias/mL de RNA genômico SARS-CoV-2 podem ser extraídas de amostras de águas residuais para detecção de transcrição reversa LAMP (RT-LAMP) e a resposta pode ser lida em 1 hora.olho nu (Fig. 2a).
Dispositivos baseados em materiais magnéticos e porosos.Diagrama conceitual do dispositivo microfluídico IFAST RT-LAMP para detecção de RNA SARS-CoV-2 (adaptado de [38]).b Microdispositivo centrífugo para dSPE de ácido nucleico de esfregaço bucal (adaptado de [39]).c Concentrador de amostra autoalimentado integrado usando um cartão FTA® (adaptado de [50]).d Papel filtro Fusion 5 modificado com quitosana (adaptado de [51]).SARS-CoV-2 síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2, amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa RT-LAMP, parceiros de tecnologia FTA Finders, ácido nucleico NA
Partículas magnéticas carregadas positivamente são ideais para fixar o esqueleto de fosfato de um ácido nucleico.A uma certa concentração de sal, os grupos fosfato de ácidos nucleicos carregados negativamente podem ser carregados positivamente na superfície das partículas de compósito magnético.Portanto, nanopartículas magnéticas com superfície rugosa e alta densidade de grupos amino foram desenvolvidas para a extração de ácidos nucléicos.Após a separação e bloqueio magnético, nanopartículas magnéticas e complexos de DNA podem ser usados diretamente na PCR, o que elimina a necessidade de operações complexas e demoradas de purificação e eluição [35].Nanopartículas magnéticas revestidas com grupos carboxila negativos também têm sido usadas para separar ácidos nucleicos adsorvidos em superfícies em soluções de alta concentração de polietilenoglicol e cloreto de sódio [36].Com essas esferas magnéticas de superfície modificada, a extração de DNA é compatível com a amplificação subsequente.Dignan et ai.[39] descreveram uma plataforma microfluídica centrífuga automatizada e portátil para pré-tratamento de ácido nucleico, permitindo que pessoal não técnico a utilizasse no local.Além disso, a compatibilidade do DNA isolado com LAMP, um método bem adequado para análise de ácido nucleico no local de atendimento, demonstra ainda os requisitos mínimos de equipamento e adequação para ensaios colorimétricos (Fig. 2b).
Os métodos de esferas magnéticas oferecem a possibilidade de extração automatizada, algumas das quais existem em extratores de ácido nucleico automatizados comerciais [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, EUA), QIAcube® HT;CapitalBio (Pequim, China) e Biomek®;Beckman (Miami, EUA).), Flórida, EUA)].As vantagens de combinar esferas magnéticas com microfluídica podem ser usadas para extração automatizada eficiente de ácidos nucleicos, o que poderia potencialmente avançar no desenvolvimento de diagnósticos moleculares;no entanto, a combinação de esferas magnéticas com microfluídica ainda depende muito de sistemas de controle complexos para manipulação precisa de esferas magnéticas, o que explica a popularidade dos produtos comerciais serem volumosos e caros, o que limita a aplicação adicional de esferas magnéticas em POCT.
Vários materiais porosos, como filtros de nitrocelulose modificados, cartões Finders Technology Associates (FTA), papéis de filtro à base de polietersulfona e materiais revestidos com glicano também têm sido usados para detecção de ácido nucleico [40, 41, 42, 43, 44].Materiais fibrosos porosos, como papel fibroso, foram usados pela primeira vez para isolar o DNA emaranhando fisicamente moléculas de DNA de fita longa com fibras.Pequenos poros levam a uma forte restrição física das moléculas de DNA, o que afeta positivamente a extração de DNA.Devido aos diferentes tamanhos de poros do papel fibroso, a eficiência de extração não pode atender às necessidades de amplificação de DNA [45, 46].O cartão FTA é um papel filtro comercial utilizado na área da medicina forense e amplamente utilizado em outras áreas do diagnóstico molecular.Através do uso de papel de filtro de celulose impregnado com vários produtos químicos para lisar as membranas celulares na amostra, o DNA liberado é protegido da degradação por até 2 anos.Mais recentemente, o papel de celulose impregnado foi desenvolvido para detecção molecular de vários patógenos, incluindo SARS-CoV-2, leishmaniose e malária [47,48,49].O HIV no plasma isolado é lisado diretamente e o ácido nucleico viral é enriquecido na membrana de fluxo FTA® incorporada ao concentrador, o que permite a produção eficiente do ácido nucleico [50] (Fig. 2c).O principal problema com a detecção de ácido nucleico usando cartões FTA é que produtos químicos como guanidina e isopropanol inibem as reações de amplificação subsequentes.Para resolver este problema, desenvolvemos o papel de filtro Fusion 5 modificado com quitosana, que combina as vantagens do entrelaçamento físico de moléculas de DNA e papel de filtro fibroso e a adsorção eletrostática de DNA em compostos modificados com quitosana para obter uma extração de ácido nucleico altamente eficiente ..fibras de filtro [51] (Fig. 2d).Da mesma forma, Zhu et al.[52] demonstraram um método de PCR modificado com quitosana baseado em um sistema microfluídico capilar in situ para rápido isolamento e detecção do RNA do vírus Zika.Os ácidos nucleicos podem ser adsorvidos/dessorvidos em um meio misto de lisado/PCR, respectivamente, com base na propriedade de liga/desliga da quitosana.ligado e desligado”, responsivo ao pH.
Como mencionado acima, essas estratégias combinam as vantagens de vários materiais de fase sólida e aumentam a eficiência da extração de ácido nucleico em microfluídica.Em aplicações práticas, o uso desses materiais em grandes quantidades é antieconômico, e o tratamento adequado da superfície ou a modificação da superfície de materiais comuns com esses materiais também podem preservar sua função.Portanto, acredita-se que a implementação dessas estratégias após um estudo piloto possa reduzir custos.
O teste de ácido nucleico em plataformas microfluídicas geralmente usa pequenos volumes de amostra (< 100 µl), portanto, requer amplificação dos ácidos nucleicos alvo com sondas específicas para conversão em um sinal que seja conveniente para detecção a jusante (óptico, elétrico e magnético) [53, 54]. O teste de ácido nucleico em plataformas microfluídicas geralmente usa pequenos volumes de amostra (< 100 µl), portanto, requer amplificação dos ácidos nucleicos alvo com sondas específicas para conversão em um sinal que seja conveniente para detecção a jusante (óptico, elétrico e magnético) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Ao testar ácidos nucleicos em plataformas microfluídicas, pequenos volumes de amostra (<100 µL) são frequentemente usados, portanto, a amplificação de ácidos nucleicos alvo com sondas especiais é necessária para convertê-lo em um sinal conveniente para detecção subsequente (óptica, elétrica e magnética) [53, 54].微流控 平台 上 核酸 检测 通常 使用 （（<100 µl） ， 因此 使用 使用 探针 探针 扩增 核酸 ， 以 转换 为 便于 下游 检测 （光学 、 电学 和 磁学）） 信号 [53, 54 ]。微流控 平台 上 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 特定 特定 扩增 目标 ， 以 以 转换 为 下游 （（、 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. A detecção de ácidos nucleicos em plataformas microfluídicas geralmente usa pequenos volumes de amostra (<100 μl), o que requer amplificação de ácidos nucleicos alvo com sondas especiais para convertê-los em sinais para detecção subsequente (óptica, elétrica e magnética) [53, 54]] .A amplificação de ácido nucleico em microfluídica também pode acelerar reações, otimizar os limites de detecção, reduzir os requisitos de amostra e melhorar a precisão da detecção [55, 56].Nos últimos anos, com a realização de detecção rápida e precisa, vários métodos de amplificação de ácidos nucleicos têm sido aplicados em microfluídica, incluindo PCR e algumas reações de amplificação isotérmica.Esta seção irá resumir métodos para detecção de ácido nucleico com base em sistemas microfluídicos.
A PCR é uma simulação do processo de replicação do DNA de um organismo, cuja teoria é descrita em detalhes em outro lugar e não será discutida aqui.A PCR pode amplificar uma quantidade muito pequena de DNA/RNA alvo a uma taxa exponencial, tornando a PCR uma ferramenta poderosa para a detecção rápida de ácidos nucleicos.Nas últimas décadas, muitos dispositivos microfluídicos portáteis equipados com sistemas de ciclagem térmica de PCR foram desenvolvidos para atender às necessidades de diagnósticos no local de atendimento [57, 58].A PCR no chip pode ser dividida em quatro tipos (convencional, fluxo contínuo, comutada espacialmente e PCR convectiva) de acordo com diferentes métodos de controle de temperatura [59].Por exemplo, Gee et ai.[60] desenvolveram um método de PCR quantitativo de transcrição reversa direta (RT-qPCR) em sua própria plataforma microfluídica para a detecção multiplex de SARS-CoV-2, vírus influenza A e B em amostras de swab de garganta (Fig. 3a).Parque et ai.[61] construíram um chip simples de análise de patógenos integrando PCR de filme fino, eletrodos e um módulo microfluídico à base de polidimetilsiloxano operado por dedo.No entanto, ambos os trabalhos incorporam as deficiências comuns da PCR convencional.A PCR requer ciclo térmico, o que limita a miniaturização do dispositivo e reduz o tempo de teste.
O desenvolvimento de PCR microfluídico baseado em fluxo contínuo e comutado por espaço é fundamental para resolver esse problema.Usando um canal serpentina longo ou um canal reto curto, a PCR de fluxo contínuo pode fornecer amplificação rápida por meio da circulação ativa de reagentes em três zonas de pré-aquecimento com uma bomba fora do chip.Esta operação evita com sucesso a fase de transição entre diferentes temperaturas de reação e, assim, reduz significativamente o tempo de teste [62] (Fig. 3b).Em outro estudo de Jung et al.[63] propuseram um novo analisador genético de PCR rotativo que combina as características de PCR fixa e de fluxo para PCR de transcrição reversa ultrarrápida e multiplex (Fig. 3c).Para amplificação de ácido nucleico, o microchip de PCR será girado através de três blocos de aquecimento em diferentes temperaturas: 1. Bloco de desnaturação a 94°C, 2. Bloco de recozimento a 58°C, 3. Bloco de expansão a 72°C.
Aplicação de PCR em microfluídica.Representação esquemática de dirRT-qPCR em uma plataforma microfluídica (adaptado de [60]).b Representação esquemática de um microarray de PCR de fluxo contínuo baseado em um canal serpentino (adaptado de [62]).c Representação esquemática de um analisador genético de PCR rotativo, composto por um microchip, três blocos de aquecimento e um motor de passo (adaptado de [63]).d Diagrama de PCR de termoconvecção com centrifugação e configuração (adaptado de [64]).DirRT-qPCR, reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa direta
Usando capilares e alças ou mesmo placas finas, a PCR por convecção pode amplificar rapidamente os ácidos nucleicos por convecção térmica livre natural sem a necessidade de uma bomba externa.Por exemplo, uma plataforma microfluídica de polímero de olefina cíclica foi desenvolvida em um estágio de aquecimento rotativo fabricado que usa ciclagem térmica com centrifugação em um microcanal de loop de PCR [64] (Fig. 3d).A solução de reação é acionada por convecção térmica, que troca continuamente alta e baixa temperatura em um microcanal com estrutura anular.Todo o processo de amplificação pode ser concluído em 10 minutos com um limite de detecção de 70,5 pg/canal.
Como esperado, a PCR rápida é uma ferramenta poderosa para sistemas de diagnóstico molecular e análise multiplex de resposta de amostra totalmente integrados.A PCR rápida reduz significativamente o tempo necessário para detectar o SARS-CoV-2, o que contribui para o controle efetivo da pandemia de COVID-19.
A PCR requer um termociclador complexo que não é adequado para POCT.Mais recentemente, técnicas de amplificação isotérmica foram aplicadas à microfluídica, incluindo, mas não se limitando a LAMP, amplificação de recombinase polimerase (RPA) e amplificação baseada em sequências de ácidos nucleicos [65,66,67,68].Com essas técnicas, os ácidos nucleicos são amplificados a uma temperatura constante, facilitando a criação de dispositivos POCT portáteis de baixo custo e alta sensibilidade para diagnóstico molecular.
Os ensaios LAMP baseados em microfluídica de alto rendimento permitem a detecção múltipla de doenças infecciosas [42, 69, 70, 71].Em combinação com um sistema microfluídico centrífugo, o LAMP pode facilitar ainda mais a automação da detecção de ácidos nucleicos [69, 72, 73, 74, 75].O SlipChip de rotação e reação foi desenvolvido para a detecção visual de múltiplas bactérias paralelas usando LAMP [76] (Fig. 4a).Ao usar LAMP otimizado no ensaio, a relação sinal-ruído de fluorescência foi de aproximadamente 5 vezes e o limite de detecção atingiu 7,2 cópias/μl de DNA genômico. Além disso, a existência de cinco patógenos bacterianos digestivos comuns, incluindo Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis e Vibrio parahaemolyticus, foram visualizados com base no método em < 60 min. Além disso, a existência de cinco patógenos bacterianos digestivos comuns, incluindo Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis e Vibrio parahaemolyticus, foram visualizados com base no método em < 60 min.Além disso, a presença de cinco patógenos bacterianos comuns do trato digestivo, incluindo Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis e Vibrio parahaemolyticus, foi visualizada usando esse método em menos de 60 minutos.此外 ， 基于 方法 在 <60 分钟 可 视化 了 五 种 消化道 细菌病 细菌病 原体 存在 ， ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 沙门 氏 菌 、 河流 弧菌 副溶血性 弧菌。。 肠 肠 氏 菌 、 河流 弧菌 和 弧菌。此外 ， 基于 方法 在 <60 分钟 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 ， ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPAlém disso, a presença de cinco patógenos gastrointestinais bacterianos comuns, incluindo Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius e Vibrio parahaemolyticus, foi visualizada usando esse método em menos de 60 minutos.
As vantagens do LAMP em microfluídica incluem, entre outras, resposta rápida e detecção miniaturizada.No entanto, devido à temperatura da reação (em torno de 70°C), aerossóis são inevitavelmente gerados durante o LAMP, resultando em uma alta taxa de falsos positivos.A especificidade do ensaio, o design do primer e o controle de temperatura também precisam ser otimizados para o LAMP.Além disso, projetos de chip que implementam detecção de múltiplos alvos em um único chip são de grande valor e devem ser desenvolvidos.Além disso, o LAMP é adequado para detecção multifuncional integrada em um chip, o que é de grande importância, mas ainda há muito espaço para desenvolvimento.
A alta taxa de falsos positivos de LAMP pode ser parcialmente reduzida com RPA, pois a temperatura de reação relativamente baixa (~37°C) resulta em relativamente poucos problemas de evaporação [77].No sistema RPA, dois primers opostos iniciam a síntese de DNA ligando-se a uma recombinase e a amplificação pode ser completada em 10 minutos [78,79,80,81].Portanto, todo o processo de RPA é muito mais rápido que PCR ou LAMP.Nos últimos anos, a tecnologia microfluídica demonstrou melhorar ainda mais a velocidade e a precisão do RPA [82,83,84].Por exemplo, Liu et ai.[85] desenvolveram um ensaio de amplificação de recombinase de polimerase de fluxo lateral integrado microfluídico para detecção rápida e sensível de SARS-CoV-2, integrando RPA de transcrição reversa (RT-RPA) e um sistema de detecção de tira de teste de fluxo lateral universal.em um único sistema microfluídico.Figura 4b).O limite de detecção é de 1 cópia/µl ou 30 cópias/amostra, e a detecção pode ser concluída em cerca de 30 minutos.Kong et ai.desenvolveram um dispositivo microfluídico vestível.[86] usaram a temperatura corporal e um sistema de detecção de fluorescência baseado em telefone celular para detectar rápida e diretamente o DNA do HIV-1 usando RPA (Figura 4c).O ensaio RPA vestível detecta 100 cópias/mL da sequência alvo em 24 minutos, demonstrando grande potencial para diagnóstico rápido de bebês infectados pelo HIV-1 em ambientes com recursos limitados.
Amplificação isotérmica em testes no local de atendimento (POCT).Desenvolvimento e produção de spin e reação SlipChip.Após a soldagem a plasma, os cavacos superiores e inferiores foram montados com um conjunto de porcas para formar o cavaco final (adaptado de [76]).b Esquema do sistema MI-IF-RPA para detecção de COVID-19 (adaptado de [85]).c Esquema de um teste de RPA vestível para detecção rápida de DNA de HIV-1 (adaptado de [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxifluoresceína, vírus da imunodeficiência humana HIV, amplificação de RPA recombinase polimerase, diodo emissor de luz LED, MI-IF-RPA Microfluidics Integrated Lateral Flow Recombinase-Pomerase Amplificação
A RPA baseada em microfluídica está se desenvolvendo rapidamente, no entanto, o custo de fabricação de chips e o consumo de reação são muito altos e devem ser reduzidos para aumentar a disponibilidade dessa tecnologia.Além disso, a alta sensibilidade do RPA pode afetar a amplificação de produtos não específicos, principalmente na presença de contaminação.Essas limitações podem afetar a aplicação de RPA em sistemas microfluídicos e merecem uma otimização adicional.Primers e sondas bem projetados para vários alvos também são necessários para melhorar a viabilidade de estratégias microfluídicas baseadas em RPA em POCT.
Cas13 e Cas12a têm a capacidade de clivar aleatoriamente ácidos nucleicos e, portanto, podem ser desenvolvidos como ferramentas de detecção e diagnóstico.Cas13 e Cas12a são ativados após a ligação ao DNA ou RNA alvo, respectivamente.Uma vez ativada, a proteína começa a clivar outros ácidos nucleicos próximos, após o que os RNAs-guia direcionados a ácidos nucleicos específicos de patógenos podem clivar sondas fluorescentes extintas e liberar fluorescência.Com base nessa teoria, Kellner et al.[87] desenvolveram um método baseado em Cas13 [Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking (SHERLOCK)], e Broughton et al.[88] desenvolveram outra abordagem baseada em Cas12a [CRISPR Trans Reporter visando DNA endonuclease (DTECR)].
Nos últimos anos, surgiram vários métodos para a detecção de ácidos nucleicos baseados em CRISPR [89, 90].Os métodos convencionais baseados em CRISPR são muitas vezes demorados e trabalhosos devido a vários procedimentos, incluindo extração de ácido nucleico, amplificação e detecção de CRISPR.A exposição de líquidos ao ar pode aumentar a chance de resultados falsos positivos.Dado o exposto, os sistemas baseados em CRISPR precisam urgentemente de otimização.
Uma plataforma microfluídica controlada pneumaticamente que pode realizar 24 análises em paralelo foi desenvolvida para aplicações de detecção CRISPR-Cas12a e CRISPR-Cas13a [91].O sistema está equipado com um dispositivo de detecção de fluorescência que ignora a amplificação de ácido nucleico e detecta automaticamente amostras de DNA e RNA femtomolar.Chen et ai.[92] amplificação de recombinase integrada com o sistema CRISPR-Cas12a em microfluídica centrífuga (Fig. 5a).Este trabalho supera a dificuldade de integrar esses dois processos porque Cas12a pode digerir o DNA mensageiro e inibir o processo de amplificação.Além disso, Chen et al.[92] adicionalmente pré-armazenou os reagentes de reação em um controle microfluídico centrífugo para completar automaticamente todo o processo.Em outro trabalho, Silva et al.[93] desenvolveram um método de diagnóstico sem amplificação CRISPR/Cas12a e um smartphone para detectar SARS-CoV-2 (Fig. 5b).Este ensaio, conhecido como sistema livre de amplificação baseado em telefone celular, inclui uma enzima dependente de CRISPR/Cas que se baseia na visualização de smartphones de sinais de bolhas gerados por catalase em canais microfluídicos.Detecção sensível de menos de 50 cópias/µl de ácido nucleico sem pré-amplificação, todo o processo desde a injeção da amostra até a leitura do sinal leva apenas 71 minutos.
Métodos de detecção de ácidos nucleicos baseados em CRISPR.POCT centrífugo para diagnóstico molecular integrado baseado em CRISPR (adaptado de [92]).b Desenvolvimento do teste CASCADE para análise de SARS-CoV-2 baseada em smartphone (adaptado de [93]).Amplificação de recombinase RAA, motivo protoespaçador adjacente PAM, repetições palindrômicas curtas agrupadas CRISPR em intervalos regulares, sistema CASCADE sem amplificação de telefone celular com enzimas dependentes de CRISPR/CAS, cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida EDC
Como a última etapa na detecção de ácido nucleico, a detecção de sinal reflete diretamente os resultados do diagnóstico e é um fator crítico no desenvolvimento de um POCT eficiente, sensível e preciso.Os sinais podem ser lidos usando vários métodos, como estratégias fluorescentes, eletroquímicas, colorimétricas e magnéticas.Nesta seção, descrevemos a lógica de cada abordagem e comparamos o diagnóstico molecular de doenças infecciosas em microfluídica.
As estratégias baseadas em fluorescência são amplamente utilizadas para diagnósticos POCT de doenças infecciosas devido às suas vantagens notáveis de excelente sensibilidade, baixo custo, facilidade de operação e análise no local de atendimento [94, 95].Essas estratégias usam fluoróforos marcados, como corantes fluorescentes e nanomateriais, para criar um sinal detectável (aumento de fluorescência ou extinção).Esta descoberta sugere que as estratégias baseadas em fluorescência podem ser divididas em marcação fluorescente direta, detecção fluorescente de sinal ligado e sinal desligado [96].A detecção direta de marcadores fluorescentes usa marcadores fluorescentes especiais para marcar ligantes específicos que geram uma quantidade específica de fluorescência quando ligados seletivamente a um alvo.Para detecção de fluorescência baseada em sinal, a qualidade do sinal fluorescente está positivamente relacionada à magnitude de interesse.A intensidade de fluorescência é insignificante na ausência de um alvo e é detectável quando uma quantidade suficiente de alvo está presente.Por outro lado, a intensidade da fluorescência detectada pela fluorescência “sinal-off” é inversamente proporcional à quantidade de alvo, atingindo inicialmente um valor máximo e diminuindo gradualmente à medida que o alvo é ampliado.Por exemplo, usando o mecanismo de trans-clivagem dependente de alvo CRISPR-Cas13a, Tian et al.[97] desenvolveram uma nova estratégia de reconhecimento para detectar RNAs que ignoram a transcrição reversa diretamente (Fig. 6a).Ao se ligar a RNAs alvo complementares, o complexo CRISPR-Cas13-RNA pode ser ativado, desencadeando a clivagem transcolateral por RNAs repórteres não específicos.O repórter marcado fluorescentemente [fluoróforo (F)] é extinto pelo inibidor (Q) intacto e fluoresce quando clivado pelo complexo ativado.
A vantagem da detecção eletroquímica é a alta velocidade de detecção, fácil produção, baixo custo, fácil de transportar e controle automático.É um método analítico poderoso para aplicações POCT.Baseado em transistores de efeito de campo de grafeno Gao et al.[98] desenvolveram um nanobiosensor para a detecção multiplex de antígenos da doença de Lyme da bactéria Borrelia burgdorferi com um limite de detecção de 2 pg/mL (Fig. 6b).
Ensaios colorimétricos têm sido utilizados em aplicações POCT, beneficiando-se das vantagens de portabilidade, baixo custo, facilidade de preparo e leitura visual.A detecção colorimétrica pode usar a oxidação de nanomateriais peroxidase ou semelhantes a peroxidase, a agregação de nanomateriais e a adição de corantes indicadores para converter informações sobre a presença de ácidos nucleicos alvo em mudanças de cor visíveis [99, 100, 101].Notavelmente, nanopartículas de ouro são amplamente utilizadas no desenvolvimento de estratégias colorimétricas e, devido à sua capacidade de induzir mudanças de cor rápidas e significativas, há um interesse crescente no desenvolvimento de plataformas colorimétricas POCT para diagnóstico in situ de doenças infecciosas [102].Com um dispositivo microfluídico centrífugo integrado [103], patógenos de origem alimentar em amostras de leite contaminadas podem ser detectados automaticamente no nível de 10 células bacterianas, e os resultados podem ser lidos visualmente em 65 minutos (Fig. 6c).
Técnicas de sensoriamento magnético podem detectar com precisão analitos usando materiais magnéticos, e tem havido um interesse significativo em aplicações POCT nas últimas décadas.As técnicas de detecção magnética têm algumas vantagens exclusivas, como materiais magnéticos de baixo custo, em vez de componentes ópticos caros.No entanto, o uso de um campo magnético melhora a eficiência de detecção e reduz o tempo de preparação da amostra [104].Além disso, os resultados da sondagem magnética demonstram alta especificidade, sensibilidade e alta relação sinal-ruído devido ao sinal de fundo magnético insignificante de amostras biológicas [105].Sharma et ai.integrou um biossensor baseado em junção de túnel magnético em uma plataforma de microchip portátil.[106] para detecção multiplex de patógenos (Fig. 6d).Os biossensores detectam com sensibilidade ácidos nucleicos subnanomolares isolados de patógenos.
Método típico de detecção de sinal.O conceito de detecção hiperlocalizada de Cas13a (adaptado de [97]).b FET nanobiosensor de grafeno em combinação com Lyme GroES scFv (adaptado de [98]).c Indicações colorimétricas para detecção multiplex de patógenos de origem alimentar em um chip microfluídico centrífugo: amostras nº 1 e nº 3 com patógenos alvo e amostras nº 2, nº 4 e nº 5 sem patógenos alvo (adaptado de [103]) .d Biossensor baseado em uma junção de túnel magnético, incluindo uma plataforma, um amplificador de bloqueio embutido, uma unidade de controle e uma fonte de alimentação para geração/aquisição de sinal (adaptado de [106]).GFET Grafeno FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimeticona, PMMA polimetil metacrilato
Apesar das excelentes características dos métodos de detecção acima, eles ainda apresentam desvantagens.Esses métodos são comparados (tabela 1), incluindo algumas aplicações com detalhes (prós e contras).
Com o desenvolvimento da microfluídica, sistemas microeletromecânicos, nanotecnologia e ciência dos materiais, o uso de chips microfluídicos para a detecção de doenças infecciosas está em constante avanço [55,96,107,108].A manipulação precisa de equipamentos e fluidos em miniatura contribui para a precisão do diagnóstico e a relação custo-benefício.Portanto, para um maior desenvolvimento, esforços foram feitos para otimizar e atualizar os chips, resultando em vários chips microfluídicos com diferentes estruturas e funções.Aqui apresentamos brevemente vários tipos comuns de plataformas microfluídicas e comparamos suas características (prós e contras).Além disso, a maioria dos exemplos listados abaixo se concentra principalmente no combate ao SARS-CoV-2.
Os LOCCs são os sistemas analíticos complexos miniaturizados mais comuns e suas operações são altamente miniaturizadas, integradas, automatizadas e paralelizadas desde a injeção e preparação da amostra, controle de fluxo e detecção de líquido [109, 110].Os líquidos são manipulados através de uma geometria cuidadosamente projetada e da interação de muitos efeitos físicos, como gradientes de pressão, ação capilar, eletrodinâmica, campos magnéticos e ondas acústicas [111].O LOCC apresenta excelentes vantagens na triagem de alto rendimento e detecção múltipla, com velocidade de análise rápida, tamanho de amostra pequeno, baixo consumo de energia e alta eficiência de gerenciamento e operação;no entanto, os dispositivos LOCC são muito delicados e de fabricação, embalagem e interface.No entanto, multiplexação e reutilização enfrentam enormes dificuldades [96].Comparado a outras plataformas, o LOCC tem vantagens únicas em termos de máxima diversidade de aplicações e melhor compatibilidade de tecnologia, mas suas desvantagens também são óbvias, como alta complexidade e baixa repetibilidade.A dependência de bombas externas, muitas vezes volumosas e caras, limita ainda mais seu uso no POCT.
Durante o surto de COVID-19, o LOCC recebeu muita atenção.Ao mesmo tempo, existem vários novos chips que combinam várias tecnologias.Por exemplo, os smartphones agora são amplamente usados como dispositivos portáteis de análise e têm grande potencial para integração LOCC.Sun et ai.[21] fabricaram um chip microfluídico que permite multiplexar sequências de ácidos nucleicos específicas de cinco patógenos, incluindo SARS-CoV-2, usando LAMP e as analisam usando um smartphone dentro de 1 hora após o término da reação.Como outro exemplo, Sundah et al.[112] criaram um interruptor molecular [amplificação catalítica por interruptor de estado de transição molecular (CATCH)] para detecção direta e sensível de alvos de RNA SARS-CoV-2 usando smartphones. CATCH é compatível com LOCC portátil e alcança desempenho superior (aproximadamente 8 cópias de RNA/μl; < 1 h em temperatura ambiente) [112]. CATCH é compatível com LOCC portátil e alcança desempenho superior (aproximadamente 8 cópias de RNA/μl; < 1 h em temperatura ambiente) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 ч при комнатной температуре) [112]. O CATCH é compatível com LOCC portátil e oferece excelente rendimento (aproximadamente 8 cópias de RNA/µl; < 1 h em temperatura ambiente) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH совместим с портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 часа при комнатной температуре) [112]. CATCH é compatível com LOCCs portáteis e tem excelente desempenho (aproximadamente 8 cópias de RNA/µl; < 1 hora em temperatura ambiente) [112].Além disso, os dispositivos LOCC para diagnóstico molecular também usam algumas forças motrizes, como vácuo, estiramento e campos elétricos.Kang et ai.[113] demonstraram uma PCR ultrarrápida de nanoplasma em um chip em tempo real para diagnóstico rápido e quantitativo de COVID-19 no campo usando um chip de PCR líquido plasmônico a vácuo.Li et ai.[114] desenvolveram posteriormente um chip microfluídico acionado por estiramento que permitiu o diagnóstico de COVID-19.A plataforma usa o sistema de amplificação RT-LAMP para determinar se uma amostra é qualitativamente positiva ou negativa.Posteriormente, Ramachandran et al.[115] conseguiram gradientes de campo elétrico apropriados usando isotacoforese (ITP), uma técnica de focagem seletiva de íons implementada em microfluídica.Com o ITP, o RNA alvo de amostras de swab nasofaríngeo bruto pode ser purificado automaticamente.Então Ramachandran et al.[115] A combinação dessa purificação de ITP com ensaios LAMP e CRISPR aprimorados por ITP detectou SARS-CoV-2 em swab nasofaríngeo humano e amostras clínicas em cerca de 35 minutos.Além disso, novas ideias surgem constantemente.Jadhav et ai.[116] propuseram um esquema de diagnóstico baseado em espectroscopia Raman de superfície aprimorada em combinação com um dispositivo microfluídico contendo nanotubos de carbono revestidos de ouro/prata orientados verticalmente ou micro/nanotubos eletrofiados descartáveis.Os microcanais de filtro integrados funcionalizados por membrana são descartáveis.O dispositivo absorve vírus de vários fluidos/exsudações corporais, como saliva, nasofaringe e lágrimas.Assim, o título do vírus é abundante e o vírus pode ser identificado com precisão pela assinatura Raman.
LOAD é uma plataforma microfluídica centrífuga na qual todos os processos são controlados por um protocolo de frequência que gira um substrato microestruturado [110].O dispositivo LOAD é caracterizado por usar a força centrífuga como uma importante força motriz.Os líquidos também estão sujeitos a forças capilares, Euler e Coriolis.Usando um dispositivo de centrifugação, as análises são realizadas em operação contínua de líquido de uma posição radial para dentro para fora, eliminando a necessidade de tubulação externa adicional, bombas, atuadores e válvulas ativas.Em suma, um único método de controle simplifica a operação.As forças que atuam sobre o líquido no mesmo canal microfluídico à mesma distância do centro de carga são iguais, o que possibilita a repetição da estrutura do canal.Assim, o equipamento LOAD é mais simples e econômico de projetar e fabricar do que o equipamento LOCC convencional, enquanto as reações são amplamente independentes e paralelizadas;no entanto, devido à alta resistência mecânica do equipamento centrífugo, o material de cavaco disponível é limitado e pequenos volumes são difíceis.para o carro.Ao mesmo tempo, a maioria dos dispositivos LOAD são projetados apenas para uso único, o que é caro para detecção em larga escala [96, 117, 118, 119].
Nas últimas décadas, o LOAD, considerado um dos dispositivos microfluídicos mais promissores, tem recebido considerável atenção de pesquisadores e fabricantes.Assim, o LOAD ganhou ampla aceitação e tem sido usado para diagnóstico molecular de patógenos infecciosos [120, 121, 122, 123, 124], especialmente durante o surto de COVID-19.Por exemplo, no final de 2020, Ji et al.[60] demonstraram um ensaio RT-qPCR direto para detecção paralela rápida e automatizada de infecções por SARS-CoV-2 e influenza A e B em amostras de zaragatoas da garganta.Então Xiong et al.[74] apresentaram uma plataforma microfluídica discóide integrada ao LAMP para detecção rápida, precisa e simultânea de sete coronavírus respiratórios humanos, incluindo SARS-CoV-2, em 40 minutos.No início de 2021, de Oliveira et al.[73] demonstraram um chip microfluídico centrífugo de toner de poliestireno, operado manualmente com um rotador na ponta do dedo, para diagnóstico molecular RT-LAMP de COVID-19.Posteriormente, Dignan et al.[39] apresentaram um microdispositivo de centrífuga portátil automatizado para purificação de RNA SARS-CoV-2 diretamente de seções de swab bucal.Medved et ai.[53] propuseram um sistema de amostragem de aerossol SARS-CoV-2 em linha com um chip microfluídico microfluídico rotativo de pequeno volume com um limite de detecção de 10 cópias/μL e um limite mínimo de ciclo de 15 minutos.Suárez et ai.[75] relataram recentemente o desenvolvimento de uma plataforma microfluídica centrífuga modular integrada para a detecção direta de RNA SARS-CoV-2 em amostras de swab nasofaríngeo inativado pelo calor usando LAMP.Esses exemplos demonstram os grandes benefícios e promessas do LOAD no diagnóstico molecular do COVID-19.
Em 1945 Muller e Clegg [125] apresentaram pela primeira vez canais microfluídicos em papel usando papel de filtro e parafina.Em 2007, o grupo Whitesides [126] criou a primeira plataforma de papel funcional para testes de proteína e glicose.O papel tornou-se um substrato ideal para microfluídica.O papel possui propriedades inerentes como hidrofilicidade e estrutura porosa, excelente biocompatibilidade, leveza, flexibilidade, dobrabilidade, baixo custo, facilidade de uso e conveniência.Os µPADs clássicos consistem em estruturas hidrofílicas/hidrofóbicas construídas em substratos de papel.Dependendo da estrutura tridimensional, os μPADs podem ser divididos em μPADs bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D).Os µPADs 2D são produzidos pela formação de limites hidrofóbicos para formar canais microfluídicos, enquanto os µPADs 3D são geralmente feitos de pilhas de camadas de papel microfluídico 2D, às vezes por dobramento de papel, técnicas de deslizamento, canais abertos e impressão 3D [96].Fluidos aquosos ou biológicos no μPAD são controlados principalmente por força capilar sem uma fonte de energia externa, facilitando o pré-armazenamento de reagentes, manuseio de amostras e detecção multiplex.No entanto, o controle preciso do fluxo e a detecção multiplex são prejudicados pela velocidade de detecção, sensibilidade e reutilização insuficientes [96, 127, 128, 129, 130].
Como uma plataforma microfluídica incomum, o μPAD foi amplamente promovido e desenvolvido para o diagnóstico molecular de doenças infecciosas como HCV, HIV e SARS-CoV-2 [131, 132].Para detecção seletiva e sensível do HCV, Tengam et al.[133] desenvolveram um novo biossensor baseado em papel fluorescente usando uma sonda de ácido nucleico altamente específica baseada no peptídeo pirrolidinil.Os ácidos nucleicos são imobilizados covalentemente em papel de celulose parcialmente oxidado por alquilação redutiva entre grupos amino e grupos aldeído, e a detecção é baseada em fluorescência.Esses sinais podem ser lidos por um dispositivo feito especialmente com uma câmera fluorescente portátil em combinação com uma câmera de telefone celular.Posteriormente, Lu et al.[134] projetaram um eletrodo flexível baseado em papel com base em nanopartículas de níquel/ouro/nanotubos de carbono/álcool polivinílico compostos de estrutura organometálica para detecção de alvos de HIV por hibridização de DNA usando azul de metileno como um indicador redox de DNA.Mais recentemente, Chowdury et al.[135] apresentaram um projeto de plataforma hipotética para testes de µPAD no local de atendimento usando saliva bruta do paciente em combinação com LAMP e tecnologia de imagem portátil para detecção de analitos COVID-19.
Testes de escoamento lateral guiam os fluidos por forças capilares e controlam o movimento do fluido pela molhabilidade e características de substratos porosos ou microestruturados.Os dispositivos de fluxo lateral consistem em amostra, conjugado, incubadora e detecção e almofadas absorventes.As moléculas de ácido nucleico no LFA reconhecem ligantes específicos que são pré-armazenados no sítio de ligação e se ligam como complexos.À medida que o líquido passa pelas placas de incubação e detecção, os complexos são capturados pelas moléculas de captura localizadas nas linhas de teste e controle, apresentando resultados que podem ser lidos diretamente a olho nu.Normalmente, o LFA pode ser concluído em 2 a 15 minutos, o que é mais rápido do que a descoberta tradicional.Devido ao mecanismo especial, o LFA requer poucas operações e não requer equipamentos adicionais, o que o torna muito fácil de usar.É fácil de fabricar e miniaturizar, e o custo dos substratos à base de papel é menor.No entanto, é usado apenas para análise qualitativa, e a detecção quantitativa é muito difícil, e a capacidade de multiplexação e o rendimento são muito limitados, e apenas um ácido nucleico suficiente pode ser detectado por vez [96,110,127].
Embora a maioria das aplicações de LFA esteja focada em imunoensaios, o uso de LFA para diagnóstico molecular em chips microfluídicos também é eficaz e popular [136].No caso do vírus da hepatite B, HIV e SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] propuseram uma plataforma LFA de nanopartículas de conversão ascendente e demonstraram a versatilidade desta plataforma miniaturizada e portátil através da detecção sensível e quantitativa de múltiplos alvos, como o ácido nucleico do HBV.Além disso, Fu e cols.[138] demonstraram um novo LFA baseado em espectroscopia Raman de superfície aprimorada para a análise quantitativa do DNA do HIV-1 em baixas concentrações.Para detecção rápida e sensível de SARS-CoV-2, Liu et al.[85] desenvolveram uma análise de fluxo lateral RPA integrado a microfluidos combinando RT-RPA e um sistema universal de detecção de fluxo lateral em um único sistema microfluídico.
A aplicação de várias plataformas microfluídicas varia de acordo com estudos específicos, aproveitando ao máximo as capacidades e vantagens das plataformas.Com válvulas, bombas e dutos acessíveis, o LOCC é a plataforma mais abrangente para diversidade de aplicações e interoperabilidade com o maior espaço para desenvolvimento.Portanto, esperamos e recomendamos que os estudos mais recentes sejam realizados no LOCC como primeira tentativa e que as condições sejam otimizadas.Além disso, espera-se que métodos mais eficientes e precisos sejam descobertos e utilizados no sistema.O LOAD se destaca no controle preciso de fluidos de dispositivos LOCC existentes e demonstra vantagens exclusivas em acionamentos únicos por força centrífuga sem a necessidade de acionamentos externos, enquanto as respostas paralelas podem ser separadas e sincronizadas.Assim, no futuro, o LOAD se tornará a principal plataforma microfluídica com menos operações manuais e tecnologias mais maduras e automatizadas.A plataforma µPAD combina os benefícios de LOCC e materiais baseados em papel para diagnósticos de baixo custo e de uso único.Portanto, o desenvolvimento futuro deve se concentrar em tecnologias convenientes e bem estabelecidas.Além disso, o LFA é adequado para detecção a olho nu, prometendo reduzir o consumo de amostras e acelerar a detecção.Uma comparação detalhada da plataforma é mostrada na Tabela 2.
As análises digitais dividem a amostra em muitos microrreatores, cada um dos quais contém um número discreto de moléculas alvo [139, 140].Os ensaios digitais oferecem vantagens significativas para realizar a quantificação absoluta, realizando milhares de experimentos bioquímicos paralelos simultaneamente e individualmente em compartimentos de escala micro, em vez de em uma fase contínua.Em comparação com a microfluídica tradicional, as reações de compartimento podem reduzir o volume da amostra, aumentar a eficiência da reação e ser facilmente integradas a outros métodos analíticos sem a necessidade de canais, bombas, válvulas e designs compactos [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Os dois métodos a seguir são usados em ensaios digitais para obter uma separação uniforme e precisa de soluções, incluindo reagentes e amostras como células, ácidos nucléicos e outras partículas ou moléculas: (1) emulsões em gotas explorando a instabilidade da interface líquida;(2) a divisão da matriz é realizada pelas restrições geométricas do dispositivo.No primeiro método, gotículas contendo reagentes e amostras em microcanais podem ser criadas por métodos passivos, como co-corrente, fluxo cruzado, focalização de fluxo, emulsificação em estágios, emulsificação de microcanais e membranas por meio de forças de cisalhamento viscoso e emulsificação com mudança de canal.localização [143, 145, 146, 148, 149] ou usando métodos ativos [150, 151], que introduzem energia adicional através de controle elétrico, magnético, térmico e mecânico.Na última abordagem, a melhor uniformidade de volume de fluido em câmaras microfluídicas é compartilhada mantendo estruturas espaciais do mesmo tamanho, como micropits e arranjos de superfície [152,153,154].Notavelmente, as gotículas são seções de fluxo principais que também podem ser geradas e manipuladas em matrizes de eletrodos com base em microfluídica digital (DMF).A eletroumedecimento de dielétricos é uma das teorias DMF mais bem estudadas, uma vez que a eletroumectação de dielétricos permite a manipulação precisa de gotas individuais, controlando a forma do líquido e sinais elétricos assimétricos que passam por diferentes lados [141, 144].As principais operações com gotículas em DMF incluem classificação, divisão e fusão [151, 155, 156], que podem ser aplicadas em vários campos de análise, especialmente na detecção molecular [157, 158, 159].
A detecção digital de ácido nucleico é uma tecnologia de diagnóstico molecular de terceira geração seguindo PCR convencional e PCR quantitativo em tempo real (qPCR), em paralelo com sequenciamento de alto rendimento e biópsia líquida.Nas últimas duas décadas, os ácidos nucleicos digitais se desenvolveram rapidamente no campo do diagnóstico molecular de patógenos infecciosos [160, 161, 162].A quantificação absoluta da detecção digital de ácido nucleico começa com a embalagem de amostras e reagentes em compartimentos individuais para garantir que cada sequência alvo tenha a mesma probabilidade de entrar em cada compartimento individual.Teoricamente, cada seção pode ser atribuída a várias sequências alvo, ou pode não haver um sistema de microrreação independente.Através dos vários mecanismos de detecção descritos acima, compartimentos com sequências alvo microbianas que geram sinais acima de um determinado limiar podem ser visualizados a olho nu ou por uma máquina e são rotulados como positivos, enquanto outros compartimentos que geram sinais abaixo do limiar são rotulados como positivos. .negativos, que tornam o sinal de cada seção um booleano.Assim, calculando o número de compartimentos criados e a taxa de resultados positivos após a reação, as cópias originais das amostras de teste podem ser comparadas usando a fórmula de distribuição de Poisson sem a necessidade de uma curva padrão, necessária para análises quantitativas de rotina, como como qPCR.[163] Em comparação com os métodos tradicionais de diagnóstico molecular, a detecção digital de ácido nucleico tem um grau mais alto de automação, maior velocidade e sensibilidade de análise, menos reagentes, menos contaminação e design e fabricação mais simples.Por essas razões, o uso de ensaios digitais, especialmente métodos baseados em gotas, para diagnóstico molecular, combinando técnicas de amplificação e leitura de sinal, foi bem estudado durante o surto crítico de SARS-CoV-2.Por exemplo, Yin et ai.[164] combinaram métodos de PCR digital e rápido de gotículas para detectar os genes ORF1ab, N e RNase P no SARS-CoV-2 em um chip microfluídico.Notavelmente, o sistema foi capaz de identificar um sinal positivo em 115 segundos, que é mais rápido que a PCR convencional, indicando sua eficácia na detecção no ponto de atendimento (Figura 7a).Dong et ai.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] e Alteri et al.[167] também aplicaram a PCR digital de gotículas (ddPCR) para detectar SARS-CoV-2 em um sistema microfluídico com resultados impressionantes.Para melhorar ainda mais a taxa de detecção, Shen et al.[168] conseguiram imagens de chip baseadas em ddPCR em menos de 15 s sem o uso de técnicas de costura de imagem, acelerando o processo da tecnologia ddPCR do laboratório para a aplicação.Não apenas métodos de amplificação térmica como PCR são aplicados, mas também métodos de amplificação isotérmica são usados para simplificar as condições de reação e resposta rápida.Lu et ai.[71] desenvolveram o SlipChip para análise de gotículas, capaz de gerar gotículas de vários tamanhos em altas densidades em uma única etapa e quantificar os ácidos nucleicos do SARS-CoV-2 usando LAMP digital (Figura 7b).Como uma tecnologia em rápida evolução, o CRISPR também pode desempenhar um papel importante na detecção digital de ácido nucleico por meio de imagens colorimétricas convenientes, sem a necessidade de colorações adicionais de ácido nucleico.Ackerman et ai.desenvolveram uma reação de matriz combinatória para avaliação multiplex de ácidos nucleicos.[158] detectaram 169 vírus associados a humanos, incluindo SARS-CoV-2, em gotículas contendo reagentes de detecção de ácido nucleico baseados em CRISPR-Cas13 em um ensaio de micropoços (Figura 7c).Além disso, a amplificação isotérmica e a tecnologia CRISPR podem ser usadas no mesmo sistema para combinar os benefícios de ambos.Parque et ai.[169] Um ensaio digital CRISPR/Cas12a foi desenvolvido em um chip microfluídico comercial para a detecção de SARS-CoV-2 extraído e morto pelo calor com base em um RT-RPA de estágio único com uma detecção de sinal para fundo mais curta e mais alta razão de tempo., faixa dinâmica mais ampla e melhor sensibilidade (Fig. 7d).Algumas descrições desses exemplos são fornecidas na Tabela 3.
Plataforma digital típica para detecção de ácidos nucleicos.a O fluxo de trabalho de PCR digital rápida consiste em quatro etapas principais: preparação da amostra, distribuição da mistura de reação, processo de amplificação e quantificação do alvo (adaptado de [164]).b Esquema mostrando a análise de gotículas SlipChip para formação de gotículas em alta densidade (adaptado de [71]).c Diagrama de fluxo de trabalho CARMEN-Cas13 (adaptado de [158]).d Visão geral da detecção avançada de vírus digital com CRISPR/Cas em um único pote (adaptado de [169]).A/O água em óleo, polidimetilsiloxano PDMS, reação em cadeia da polimerase PCR, coleta de dados DAQ, derivado integral proporcional PID, reação de matriz combinatória CARMEN para avaliação de ácido nucleico multiplex, SARS-CoV-2, síndrome respiratória aguda grave, coronavírus 2 , Amplificação de RT de transcriptase reversa recombinase polimerase-RPA, sinal S/B em segundo plano
Horário da postagem: 15 de setembro de 2022
