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Métodos de marcação de proximidade enzimática baseados em ésteres ativados ou radicais fenoxi são amplamente utilizados para mapear proteomas subcelulares e interatores de proteínas em células vivas.No entanto, ésteres ativados são menos reativos, resultando em um amplo raio de marcação, e os radicais fenoxi gerados pelo tratamento com peróxido podem interferir nas vias redox.Aqui relatamos um método de fotoativação dependente de marcação de proximidade (PDPL) desenvolvido pela ligação genética da proteína fotossensibilizadora miniSOG a uma proteína de interesse.Acionado pela luz azul e controlado pelo tempo de exposição, o oxigênio singlete é gerado e, em seguida, a marcação dos resíduos de histidina resolvida espaço-temporalmente pela sonda de anilina é alcançada.Demonstramos sua alta fidelidade através do mapeamento de proteoma específico de organela.Uma comparação lado a lado do PDPL com o TurboID mostra uma cobertura proteômica mais específica e abrangente do PDPL.Em seguida, aplicamos PDPL ao coativador transcricional associado à doença BRD4 e E3 Parkin ligase e encontramos interatores previamente desconhecidos.Por triagem de superexpressão, dois substratos desconhecidos, Ssu72 e SNW1, foram identificados para Parkina, cuja degradação é mediada pela via ubiquitinação-proteassoma.
A caracterização precisa de redes de proteínas é a base de muitos processos celulares fundamentais.Portanto, o mapeamento espaço-temporal altamente preciso das interações de proteínas fornecerá uma base molecular para decifrar as vias biológicas, a patologia da doença e interromper essas interações para fins terapêuticos.Para tanto, métodos capazes de detectar interações temporais em células ou tecidos vivos são altamente desejáveis.A Espectrometria de Massa de Purificação de Afinidade (AP-MS) tem sido historicamente usada para identificar parceiros de ligação de proteínas de interesse (POIs).Com o desenvolvimento de métodos de proteômica quantitativa, foi criado o Bioplex3.0, o maior banco de dados de redes de proteínas baseado em AP-MS.Embora o AP-MS seja muito poderoso, as etapas de lise e diluição de células no fluxo de trabalho são direcionadas para interações de ligação fracas e transitórias e introduzem artefatos pós-lise, como pares de interação espúrios que não possuem compartimentação antes da lise.
Para resolver esses problemas, foram desenvolvidos aminoácidos não naturais (UAA) com grupos de reticulação e plataformas de rotulagem enzimática próxima (PL) (por exemplo, APEX e BioID)5.Embora o método UAA tenha sido aplicado com sucesso em muitos cenários e forneça informações sobre adesivos proteicos diretos, a otimização do local de inserção do UAA ainda é necessária.Mais importante, é um método de marcação estequiométrica que não possui uma reversão catalítica de eventos de marcação.Em contraste, os métodos enzimáticos de PL, como o método BioID, fundem a ligase de biotina manipulada com POI7, que subsequentemente ativa a biotina para formar um intermediário reativo de éster de biotinil-AMP.A enzima catalisa e libera uma “nuvem” de biotina ativada que marca os resíduos de lisina proximais.No entanto, o BioID requer mais de 12 horas para obter um sinal marcado suficiente, o que impossibilita seu uso com resolução temporal.Utilizando evolução direcionada com base na exibição de leveduras, o TurboID foi projetado com base no BioID para ser mais eficiente, permitindo rotulagem eficiente com biotina em 10 minutos, permitindo que processos mais dinâmicos sejam estudados.Como o TurboID é altamente ativo e os níveis de biotina endógena são suficientes para marcação de baixo nível, a marcação de fundo se torna um problema potencial quando a marcação altamente aprimorada e temporizada é necessária pela adição de biotina exógena.Além disso, ésteres ativados são pouco reativos (t1/2 ~ 5 min), o que pode levar a um grande raio de marcação, especialmente após a saturação de proteínas vizinhas com biotina 5. Em outra abordagem, a fusão genética de peroxidase de ascorbato manipulada (ou seja, biotina- fenol e permite a marcação de proteínas em um minuto9,10. O APEX é amplamente utilizado para identificar proteomas subcelulares, complexos de proteínas de membrana e complexos de proteínas de sinalização citosólica11,12. No entanto, a necessidade de altas concentrações de peróxidos pode afetar proteínas ou vias redox, interrompendo processos celulares.
Assim, um novo método capaz de gerar espécies de supressão de raio marcado mais reativas com alta precisão espacial e temporal sem interromper significativamente as vias celulares será uma adição importante aos métodos existentes. Entre as espécies reativas, o oxigênio singlete despertou nossa atenção devido ao seu curto tempo de vida e raio de difusão limitado (t1/2 < 0,6 µs nas células)13. Entre as espécies reativas, o oxigênio singlete despertou nossa atenção devido ao seu curto tempo de vida e raio de difusão limitado (t1/2 < 0,6 µs nas células)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Entre as formas ativas, o oxigênio singlete atraiu nossa atenção devido ao seu curto tempo de vida e raio de difusão limitado (t1/2 < 0,6 µs nas células)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Entre as formas ativas, o oxigênio singlete atrai nossa atenção devido ao seu curto tempo de vida e raio de difusão limitado (t1/2 < 0,6 μs nas células).Foi relatado que o oxigênio singlete oxida aleatoriamente metionina, tirosina, histidina e triptofano, tornando-o polar 14,15 para ligação a sondas à base de amina ou tiol16,17.Embora o oxigênio singlete tenha sido usado para rotular o RNA do compartimento subcelular, estratégias para reaproveitar marcadores de proximidade de POI endógenos permanecem inexploradas.Aqui, apresentamos uma plataforma chamada rotulagem de proximidade dependente de fotoativação (PDPL), onde usamos luz azul para iluminar POIs fundidos com um fotossensibilizador miniSOG e acionar a geração de oxigênio singlete para oxidar resíduos proximais, seguido por modificações contendo aminas para oxidar sondas químicas em células vivas intermediárias..Testamos um grupo de sondas químicas para maximizar a especificidade da etiqueta e identificar locais de modificação usando um fluxo de trabalho de proteômica aberta.Uma comparação lado a lado do PDPL com o TurboID mostra uma cobertura proteômica mais específica e abrangente do PDPL.Aplicamos essa abordagem a marcadores específicos de organelas do proteoma subcelular e identificação geral do proteoma de parceiros de ligação para a proteína reguladora epigenética associada ao câncer BRD4 e a ligase E3 associada à doença de Parkinson Parkin, que confirmou uma rede conhecida e uma desconhecida de proteínas interações..A capacidade do PDPL de reconhecer substratos E3 em grandes complexos de proteínas representa uma situação em que o reconhecimento de ligantes indiretos é necessário.Dois substratos de parkin desconhecidos mediados por ubiquitinação-proteassoma foram confirmados in situ.
A terapia fotodinâmica (PDT)19 e a inativação por laser assistida por cromóforo (CALI)20, em que a irradiação de luz com fotossensibilizadores gera oxigênio singlete, pode inativar proteínas-alvo ou causar morte celular.Como o oxigênio singlete é uma substância altamente reativa com uma distância teórica de difusão de cerca de 70 nm, a oxidação espacialmente limitada ao redor do fotossensibilizador pode ser controlada.Com base nesse conceito, decidimos usar oxigênio singlete para obter uma marcação próxima de complexos proteicos em células vivas.Desenvolvemos uma abordagem quimioproteômica PDPL para cumprir quatro funções: (1) catalisar a geração de oxigênio singlete ativo semelhante à abordagem enzimática PL;(2) fornecer rotulagem resolvida no tempo após a iniciação da luz;(3) por alteração (4) Evite usar cofatores endógenos (como biotina) para reduzir o fundo, ou use reagentes exógenos altamente perturbadores (como peróxidos) para minimizar a exposição das células ao estresse ambiental.
Os fotossensibilizadores podem ser divididos em duas categorias, incluindo fluoróforos de baixo peso molecular (por exemplo, rosa de bengala, azul de metileno)22 e pequenas proteínas geneticamente codificadas (por exemplo, miniSOG, KillerRed)23.Para alcançar um design modular, desenvolvemos a plataforma PDPL de primeira geração, adicionando proteínas fotossensibilizadoras (PS) ao POI24,25 (Figura 1a).Quando irradiado com luz azul, o oxigênio singlete oxida os resíduos de aminoácidos nucleofílicos proximais, resultando em uma polaridade umpolung que é eletrofílica e pode reagir ainda mais com os nucleófilos da sonda amina16,17.A sonda é projetada com uma alça de alcino para permitir química de clique e puxar para baixo para caracterização LC/MS/MS.
Ilustração esquemática da marcação de complexos proteicos mediados por miniSOG.Quando expostas à luz azul, as células que expressam miniSOG-POI geram oxigênio singlete, que modifica as proteínas que interagem, mas não as proteínas que não se ligam.Produtos intermediários de fotooxidação são interceptados por marcadores de retransmissão da sonda química de amina para formar adutos covalentes.O grupo alquinil na sonda química permite a química de clique para enriquecimento por pull-down seguido de quantificação LC-MS/MS.b Estrutura química das sondas de amina 1-4.c Análise de gel fluorescente representativa de marcadores proteômicos mediados por miniSOG localizados mitocondriais usando sondas 1-4 e quantificação relativa com base em densitometria em gel.A relação sinal-fundo de sondas químicas foi avaliada usando experimentos de controle negativo excluindo luz azul ou usando células HEK293T sem expressão miniSOG.n = 2 amostras biologicamente independentes.Cada ponto representa uma réplica biológica.d Detecção e quantificação representativa de PDPL usando a sonda 3 otimizada na presença ou ausência dos componentes de PDPL indicados como c.n = 3 amostras biologicamente independentes.Cada ponto representa uma réplica biológica.Linhas centrais e bigodes representam a média e ± desvio padrão.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Imagem confocal de oxigênio singlete com coloração de Si-DMA vermelho distante.Barra de escala: 10 µm.Imagens de gel e experimentos confocais foram repetidos independentemente pelo menos duas vezes com resultados semelhantes.
Primeiro testamos a capacidade dos fotossensibilizadores maduros miniSOG26 e KillerRed23, expressos de forma estável em HEK293T, para mediar a marcação de propargilamina do proteoma como uma sonda química (Fig. 1a complementar).A análise de fluorescência do gel mostrou que a marcação de todo o proteoma foi alcançada usando miniSOG e irradiação de luz azul, enquanto nenhum produto de marcação visível foi observado com KillerRed.Para melhorar a relação sinal-fundo, testamos um conjunto de sondas químicas contendo anilina (1 e 3), propilamina (2) ou benzilamina (4).Observamos que as próprias células HEK293T tinham um sinal de fundo mais alto em comparação com nenhuma luz azul, possivelmente devido ao fotossensibilizador riboflavina endógeno, mononucleotídeo de flavina (FMN) 27 . As sondas químicas à base de anilina 1 e 3 deram melhor especificidade, com HEK293T expressando de forma estável miniSOG nas mitocôndrias exibindo um aumento >8 vezes no sinal para a sonda 3, enquanto a sonda 2 usada no método de marcação de RNA CAP-seq exibindo apenas ~2,5- aumento do sinal de dobra, provavelmente devido a diferentes preferências de reatividade entre RNA e proteína (Fig. 1b, c). As sondas químicas à base de anilina 1 e 3 deram melhor especificidade, com HEK293T expressando de forma estável miniSOG nas mitocôndrias exibindo um aumento >8 vezes no sinal para a sonda 3, enquanto a sonda 2 usada no método de marcação de RNA CAP-seq exibindo apenas ~2,5- aumento do sinal de dobra, provavelmente devido a diferentes preferências de reatividade entre RNA e proteína (Fig. 1b, c).As sondas químicas à base de anilina 1 e 3 mostraram melhor especificidade: HEK293T, que expressa miniSOG de forma estável nas mitocôndrias, mostra um aumento de mais de 8 vezes no sinal para a sonda 3, enquanto a sonda 2, usada no método de marcação de RNA CAP-seq, apenas mostra um aumento de sinal de ~2,5 vezes, provavelmente devido a diferentes preferências de reatividade entre RNA e proteína (Fig. 1b, c).基于 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， HEK293T 在 线 粒体 中 表达 MiniSog ， 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 ， 而 用 rna 标记 方法 cap-seq 的 探针 2 仅 显示 而2.5-倍信号增加，可能是由于RNA和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 化学 探针 1 和 3 具有 更 特异性 ， HEK293T 在 粒体 中 表达 MiniSog ， 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 而 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAAs sondas químicas à base de anilina 1 e 3 tiveram melhor especificidade, HEK293T expressou miniSOG de forma estável nas mitocôndrias e a sonda 3 teve um aumento de mais de 8 vezes no sinal, enquanto a sonda 2 para o método de marcação de RNA CAP-seq mostrou apenas ~ 2,5 vezes de aumento.no sinal, provavelmente devido a diferentes preferências de reação entre RNA e proteína (Fig. 1b, c).Além disso, os isômeros da sonda 3 e sondas de hidrazina (sondas 5, 6, 7) foram testados, confirmando a otimização da sonda 3 (Fig. Suplementar 1b,c).Da mesma forma, a análise de fluorescência em gel revelou outros parâmetros experimentais otimizados: comprimento de onda de irradiação (460 nm), concentração de sonda química (1 mM) e tempo de irradiação (20 min) (Fig. 2a–c suplementar).A omissão de qualquer componente ou etapa no protocolo PDPL resultou em reversão significativa do sinal para o fundo (Fig. 1d).Notavelmente, a marcação de proteínas foi significativamente reduzida na presença de azida de sódio ou trolox, que são conhecidos por extinguir o oxigênio singlete.A presença de D2O, que é conhecido por estabilizar o oxigênio singlete, aumenta o sinal de marcação.Para investigar a contribuição de outras espécies reativas de oxigênio para a marcação, manitol e vitamina C foram adicionados para estabelecer sequestradores de radicais hidroxila e superóxido, respectivamente, 18, 29, mas não foram encontrados para reduzir a marcação.A adição de H2O2, mas não a iluminação, não resultou na marcação (Fig. 3a complementar).A imagem de fluorescência de oxigênio singlete com sondas Si-DMA confirmou a presença de oxigênio singlete no fio HEK293T-miniSOG, mas não no fio HEK293T original.Além disso, mitoSOX Red não pôde detectar a produção de superóxido após a iluminação (Fig. 1e e Fig. 3b suplementar) 30. Esses dados sugerem fortemente que o oxigênio singlete é a principal espécie reativa de oxigênio responsável pela marcação proteômica subsequente.A citotoxicidade de PDPL foi avaliada incluindo irradiação de luz azul e sondas químicas, e nenhuma citotoxicidade significativa foi observada (Fig. 4a complementar).
Para estudar o mecanismo de marcação e permitir a identificação proteômica de complexos de proteínas usando LC-MS/MS, primeiro precisamos determinar quais aminoácidos são modificados e a massa delta dos marcadores de sonda.Metionina, histidina, triptofano e tirosina foram modificados pelo oxigênio singlete14,15.Integramos o fluxo de trabalho TOP-ABPP31 com a pesquisa aberta imparcial fornecida pela plataforma de computação FragPipe baseada em MSFragger32.Após a modificação do oxigênio singlete e a marcação da sonda química, a química do clique foi realizada usando um marcador de redução de biotina contendo um ligante clivável, seguido de alongamento de neutravidina e digestão com tripsina.O peptídeo modificado, ainda ligado à resina, foi fotoclivado para análise LC-MS/MS (Figura 2a e Dados Suplementares 1).Um grande número de modificações ocorreu em todo o proteoma com mais de 50 correspondências de mapa de peptídeos (PSM) listadas (Fig. 2b).Surpreendentemente, observamos apenas modificação da histidina, provavelmente devido à maior reatividade da histidina oxidada em relação às sondas de anilina do que outros aminoácidos.De acordo com o mecanismo publicado de oxidação da histidina por oxigênio singlete,21,33 a estrutura delta-massa proposta de +229 Da corresponde ao aduto da sonda 3 com 2-oxo-histidina após duas oxidações, enquanto +247 Da é o produto da hidrólise de +229 Da (Fig. 5 Suplementar).A avaliação do espectro MS2 mostrou uma alta confiabilidade de identificação da maioria dos íons y e b, incluindo a identificação de íons fragmentos modificados (y e b) (Fig. 2c).A análise de contexto da sequência local de histidinas modificadas com PDPL revelou uma preferência de motivo moderada para pequenos resíduos hidrofóbicos em ±1 posições (Fig. 4b suplementar).Em média, 1,4 histidinas foram identificadas por proteína, e os sítios desses marcadores foram determinados por análise de área de superfície acessível ao solvente (SASA) e disponibilidade relativa de solvente (RSA) (Fig. 4c,d suplementar).
Um fluxo de trabalho imparcial para estudar a seletividade residual usando a plataforma de computação FragPipe desenvolvida por MSFragger.Os ligantes cliváveis ​​são usados ​​na química Click para permitir a fotoclivagem de peptídeos modificados da resina de estreptavidina.Uma busca aberta foi lançada para identificar inúmeras modificações, bem como remanescentes relevantes.b Atribua a massa de modificações que ocorrem em todo o proteoma.Mapeamento de peptídeos PSM.c Anotação espectral MS2 de sítios de histidina modificados com a sonda 3. Como exemplo representativo, uma reação covalente com a sonda 3 adicionou +229,0938 Da ao aminoácido modificado.d Ensaio de mutação usado para testar marcadores PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) e PRDX1 (H10A, H81A, H169A) foram transfectados com plasmídeos de tipo selvagem para detecção anti-Flag.e O peptídeo sintético foi reagido com miniSOG purificado na presença da sonda 3 e os produtos correspondentes com Δm +247 e +229 foram observados no espectro de LC-MS.f Interações proteína-proteína in vitro modeladas com miniSOG-6xHis-tag e anticorpo anti-6xHis.Análise de antibiotina (estreptavidina-HRP) e anti-rato de Western blot de complexos de anticorpo miniSOG-6xHis/anti-6xHis marcados com a sonda 3, dependendo do tempo de exposição à luz.Os marcadores para proteínas individuais são expressos no peso molecular correspondente: cadeia leve do anticorpo LC, cadeia pesada do anticorpo HC.Esses experimentos foram repetidos independentemente pelo menos duas vezes com resultados semelhantes.
Para verificação bioquímica do local de marcação, PRDX3 e PRDX1 identificados por espectrometria de massa foram alterados de histidina para alanina e comparados ao tipo selvagem em ensaios de transfecção.Os resultados de PDPL mostraram que a mutação reduziu significativamente a marcação (Fig. 2d).Enquanto isso, as sequências peptídicas identificadas na busca aberta foram sintetizadas e reagiram in vitro com miniSOG purificado na presença da sonda 3 e luz azul, produzindo produtos com deslocamento de massa de +247 e +229 Da quando detectados por LC-MS (Fig. . 2e).).Para testar se as proteínas proximais que interagem podem ser marcadas in vitro em resposta à fotoativação miniSOG, projetamos um ensaio de proximidade artificial pela interação entre a proteína miniSOG-6xHis e um anticorpo monoclonal anti-His in vitro (Figura 2f).Neste ensaio, esperávamos a marcação proximal de cadeias pesadas e leves de anticorpos com miniSOG.De fato, os Western blots anti-ratinho (reconhecendo as cadeias pesada e leve do anticorpo marcado com anti-6xHis) e estreptavidina mostraram forte biotinilação das cadeias pesada e leve.Notavelmente, notamos autobiotinilação de miniSOG devido à tag 6xHis e ligações cruzadas entre cadeias leves e pesadas, o que pode estar relacionado ao gap descrito anteriormente entre a resposta proximal de lisina e 2-oxo-histidina.Em conclusão, concluímos que o PDPL modifica a histidina de maneira dependente da proximidade.
Nosso próximo objetivo foi caracterizar o proteoma subcelular para testar a especificidade da marcação in situ.Portanto, expressamos miniSOG de forma estável no núcleo, matriz mitocondrial ou membrana ER externa de células HEK293T (Fig. 3a).A análise de fluorescência do gel revelou bandas marcadas abundantes em três locais subcelulares, bem como diferentes padrões de marcação (Fig. 3b).A análise de imagem de fluorescência mostrou alta especificidade de PDPL (Fig. 3c).O fluxo de trabalho PDPL foi seguido por reações de clique com corantes rodamina para delinear proteomas subcelulares usando microscopia de fluorescência, e os sinais PDPL foram colocalizados com DAPI, rastreadores mitocondriais ou rastreadores ER, confirmando a alta fidelidade do PDPL.Para as três localizações de organelas, uma comparação lado a lado de PDPL com TurboID usando avidina western blot mostrou que PDPL foi rotulado mais especificamente em comparação com seus respectivos controles.Sob condições de PDPL, mais bandas marcadas apareceram, indicando mais proteínas marcadas com PDPL (Fig. 6a-d suplementar).
a Representação esquemática da marcação de proteoma específica de organela mediada por miniSOG.O miniSOG tem como alvo a matriz mitocondrial através da fusão com os 23 aminoácidos N-terminais da COX4 humana (mito-miniSOG), o núcleo através da fusão com H2B (núcleo-miniSOG) e Sec61β através do lado citoplasmático da membrana do ER (ER-miniSOG ).As indicações incluem imagem em gel, imagem confocal e espectrometria de massa.b Imagens de gel representativas de três perfis de PDPL específicos de organelas.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Imagens confocais representativas de células HEK293T expressando miniSOG de forma estável com diferentes localizações subcelulares detectadas por V5 marcado com anticorpo (vermelho).Marcadores subcelulares são usados ​​para mitocôndrias e ER (verde).O fluxo de trabalho PDPL inclui a detecção de proteomas subcelulares marcados com miniSOG (amarelo) usando a química de clique Cy3-azide.Barra de escala: 10 µm.d Gráficos vulcânicos de proteomas marcados com PDPL em várias organelas quantificados por quantificação não marcada (n = 3 experimentos biológicos independentes).O teste t de Student bicaudal foi usado em gráficos de vulcões.O tipo selvagem HEK293T foi usado como controle negativo. Proteínas significativamente alteradas estão destacadas em vermelho (p < 0,05 e >2 vezes a diferença de intensidade de íons). Proteínas significativamente alteradas estão destacadas em vermelho (p < 0,05 e >2 vezes a diferença de intensidade de íons). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ион интенсивности ). As proteínas significativamente alteradas estão destacadas em vermelho (p < 0,05 e >2 vezes a diferença na intensidade do íon).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). As proteínas significativamente alteradas estão destacadas em vermelho (p < 0,05 e > 2 vezes a diferença na força iônica).Proteínas relacionadas importantes para HEK293T-miniSOG, mas não importantes para HEK293T, são mostradas em verde.e Análise da especificidade de conjuntos de dados proteômicos de experimentos d.O número total de proteínas estatisticamente significativas em cada organela (pontos vermelhos e verdes) está marcado no topo.Os histogramas mostram proteínas localizadas em organelas com base em MitoCarta 3.0, análise de GO e A. Ting et al.pessoas.Conjuntos de dados separados para mitocôndrias, núcleos e ER.Esses experimentos foram repetidos independentemente pelo menos duas vezes com resultados semelhantes.Os dados brutos são fornecidos na forma de arquivos de dados brutos.
Incentivada pelo gel e pelos resultados de imagem, a quantificação sem rótulo foi usada para quantificar o proteoma identificado em cada organela (Dados Suplementares 2).HEK293T não transfectado foi usado como controle negativo para subtrair marcadores de fundo. A análise do gráfico do vulcão apresentou proteínas significativamente enriquecidas (p < 0,05 e > 2 vezes a intensidade de íons), bem como proteínas singleton que estão presentes apenas em linhas que expressam miniSOG (Fig. 3d pontos vermelhos e verdes). A análise do gráfico do vulcão apresentou proteínas significativamente enriquecidas (p < 0,05 e > 2 vezes a intensidade de íons), bem como proteínas singleton que estão presentes apenas em linhas que expressam miniSOG (Fig. 3d pontos vermelhos e verdes). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). A análise do Volcano plot mostrou proteínas significativamente enriquecidas (p<0,05 e >2 vezes a intensidade do íon), bem como proteínas únicas que estão presentes apenas em linhas que expressam miniSOG (Fig. 3d, pontos vermelhos e verdes).火山图 分析 显示 显着 富集 的 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 强度 强度） 以及 仅 存 在于 minisog 表达 系 中 单一 蛋白质 （（图 3d 红色 绿色点））。。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). A análise do Volcano plot revelou proteínas significativamente enriquecidas (p<0,05 e >2x força iônica), bem como proteínas únicas presentes apenas na linha de expressão miniSOG (pontos vermelhos e verdes na Fig. 3d).Combinando esses dados, identificamos 1364, 461 e 911 proteínas de membrana externa nuclear, mitocondrial e ER estatisticamente significativas, respectivamente.Para analisar a precisão do PDPL localizado em organelas, usamos MitoCarta 3.0, análise de Gene Ontology (GO) e A. Ting et al.um conjunto de dados8 foi usado para mitocôndrias, núcleo e ER para testar a especificidade de organelas das proteínas detectadas, correspondendo a uma precisão de 73,4, 78,5 e 73,0% (Fig. 3e).A especificidade do PDPL confirma que o PDPL é uma ferramenta ideal para identificar proteomas específicos de organelas.Notavelmente, a análise subocondrial das proteínas mitocondriais identificadas mostrou que o proteoma aprisionado estava distribuído principalmente na matriz e membrana interna (226 e 106, respectivamente), respondendo por 91,7% (362) do número total de proteínas mitocondriais identificadas.um alto nível de PDPL foi adicionalmente confirmado (Fig. 7a complementar).Da mesma forma, a análise subnuclear mostrou que o proteoma capturado foi distribuído principalmente no núcleo, nucleoplasma e nucléolo (Fig. 7b suplementar).A análise proteômica nuclear com um peptídeo sinal de localização nuclear (3xNLS) mostrou precisão semelhante ao construto H2B (Fig. 7c-h suplementar).Para determinar a especificidade do marcador PDPL, a laminina nuclear A foi escolhida como uma armadilha POI7 mais discretamente localizada.O PDPL identificou 36 proteínas significativamente enriquecidas, das quais 12 proteínas (30,0% incluindo lâmina A) eram proteínas de interação com lâmina A bem caracterizadas anotadas pelo banco de dados String, com uma porcentagem maior que o método BioID (122 proteínas) 28 de 28. , 22,9 %) 7. Nosso método identificou menos proteínas, possivelmente devido a áreas de marcação limitadas, o que foi possível pelo oxigênio singlete mais ativo.A análise GO mostrou que as proteínas identificadas estavam localizadas principalmente no nucleoplasma (26), membrana nuclear (10), membrana nuclear (9) e poros nucleares (5).Coletivamente, essas proteínas localizadas no núcleo representaram 80% das proteínas enriquecidas, demonstrando ainda mais a especificidade do PDPL (Fig. 8a–d suplementar).
Tendo estabelecido a capacidade do PDPL de realizar marcação de proximidade em organelas, testamos se o PDPL poderia ser usado para analisar parceiros de ligação de POI.Em particular, procuramos definir a análise PDPL de proteínas citosólicas, que são consideradas alvos mais difíceis do que suas contrapartes localizadas na membrana devido à sua natureza altamente dinâmica.O bromodomínio e a proteína extraterminal (BET) BRD4 tem atraído nossa atenção por seu papel fundamental em diversas doenças 35, 36 .O complexo formado por BRD4 é um coativador transcricional e um importante alvo terapêutico.Ao regular a expressão dos fatores de transcrição c-myc e Wnt5a, acredita-se que BRD4 seja um determinante chave da leucemia mieloide aguda (LMA), mieloma múltiplo, linfoma de Burkitt, câncer de cólon e doenças inflamatórias37,38.Além disso, alguns vírus têm como alvo o BRD4 para regular a transcrição viral e celular, como papilomavírus, HIV e SARS-CoV-236,39.
Para mapear a interação BRD4 usando PDPL, combinamos miniSOG com uma isoforma curta N- ou C-terminal de BRD4.Os resultados proteômicos revelaram um alto grau de sobreposição entre as duas construções (Fig. 9a complementar).O proteoma nuclear identificado com miniSOG-H2B cobre 77,6% das proteínas que interagem com BRD4 (Fig. 9b suplementar).Em seguida, diferentes tempos de iluminação (2, 5, 10, 20 min) foram usados ​​para ajustar o raio do marcador (Fig. 4a e dados suplementares 3).Concluímos que em fotoperíodos mais curtos, PDPL marcará principalmente parceiros de ligação direta, enquanto períodos mais longos incluirão proteínas identificadas durante períodos de fotoativação mais curtos, bem como alvos indiretos em complexos de marcação.De fato, encontramos forte sobreposição entre pontos de tempo adjacentes (84,6% para 2 e 5 min; 87,7% para 5 e 10 min; 98,7% para 10 e 20 min) (Fig. 4b e Fig. 9c Suplementar).Em todos os grupos experimentais, encontramos não apenas a auto-rotulagem de BRD4, mas vários alvos conhecidos como MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A e HMGB1 anotados no banco de dados de strings.A força iônica desses alvos é proporcional ao tempo de exposição (Fig. 4c e Fig. 9d suplementar).A análise GO das proteínas identificadas no grupo de 2 minutos mostrou que as proteínas identificadas estavam localizadas no núcleo e estavam envolvidas na remodelação da cromatina e na função da RNA polimerase.A função molecular da proteína foi enriquecida em ligação à cromatina ou coativação transcricional, consistente com a função BRD4 (Fig. 4d).A análise de interação de proteínas habilitada para banco de dados de cadeia revelou um primeiro nível de interações indiretas entre BRD4 e complexos de interação da família HDAC, como SIN3A, NCOR2, BCOR e SAP130 (Fig. 4e e Fig. 9e Complementar), consistente com histonas acetiladas de ligação de BRD4 e HDAC ..Além disso, alvos representativos identificados por LC-MS/MS, incluindo Sin3A, NSUN2, Fus e SFPQ, foram confirmados por Western blotting (Fig. 4f).Recentemente, a isoforma curta de BRD4 foi relatada para formar núcleos com propriedades de separação de fase líquido-líquido (LLPS).As proteínas de ligação de RNA Fus e SFPQ medeiam o LLPS de vários processos celulares e foram identificadas aqui como proteínas de ligação a BRD4 não registradas.A interação entre BRD4 e SFPQ foi confirmada por experimentos de co-imunoprecipitação (co-IP) (Figura 4g), sugerindo outro mecanismo para separação de fase líquido-líquido mediada por BRD4 que merece investigação adicional.Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que o PDPL é uma plataforma ideal para identificar proteínas que interagem com BRD4 conhecidas, bem como proteínas de ligação desconhecidas.
a Representação esquemática da marcação de proximidade BRD4 mediada por miniSOG, tempos de exposição: 2, 5, 10 e 20 min.b Sobreposição de proteínas identificadas em diferentes tempos de iluminação.O enriquecimento proteico identificado em HEK293T-miniSOG-BRD4 foi estatisticamente significativo em comparação com HEK293T de tipo selvagem.c Intensidade de íons ao quantificar proteínas de ligação a BRD4 conhecidas representativas não rotuladas durante o tempo de exposição especificado.n = 3 amostras biologicamente independentes.Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.d Análise ontológica gênica (GO) das proteínas identificadas no grupo de 2 minutos.Os primeiros dez termos GO são listados.As bolhas são coloridas de acordo com a categoria do termo GO, e o tamanho da bolha é proporcional ao número de proteínas encontradas em cada termo.e Análise de strings de proteínas interagindo com BRD4.Os círculos amarelos são cola direta e os círculos cinza são a primeira camada de cola indireta.As linhas vermelhas representam as interações determinadas experimentalmente e as linhas azuis representam as interações previstas.f Os alvos de ligação BRD4 representativos identificados em LC-MS/MS foram verificados por Western blotting.g Experimentos de co-imunoprecipitação confirmam a interação entre SFPQ e BRD4.Esses experimentos foram repetidos independentemente pelo menos duas vezes com resultados semelhantes.Os dados brutos são fornecidos na forma de arquivos de dados brutos.
Além de identificar alvos associados a POI não registrados, hipotetizamos que PDPL será adequado para identificar substratos para enzimas, o que exigiria a caracterização de proteínas de ligação indireta em grandes complexos para anotar substratos não registrados.A parkina (codificada por PARK2) é uma ligase E3 e sabe-se que as mutações na parkina causam a doença de Parkinson juvenil autossômica recessiva (AR-JP)42.Além disso, a parkina foi descrita como essencial para a mitofagia (autofagia mitocondrial) e remoção de espécies reativas de oxigênio.No entanto, embora vários substratos de parkin tenham sido identificados, o papel do parkin nesta doença permanece incerto.Para anotar seus substratos não caracterizados, o PDPL foi testado adicionando miniSOG ao terminal N ou C da parkina.As células foram tratadas com o transportador de prótons de cianeto de carbonila m-clorofenilhidrazona (CCCP) para ativar a parkina pela via PINK1-Parkin.Em comparação com nossos resultados de BRD4 PDPL, a fusão do terminal N da parkina revelou um conjunto maior de proteínas alvo, embora cobrisse uma porção maior do terminal C (177 de 210) (Figura 5a,b e dados suplementares 4).o resultado é consistente com os relatórios de que as tags N-terminais podem ativar de forma aberrante o Parkin44.Surpreendentemente, havia apenas 18 proteínas sobrepostas em nossos dados com resultados de AP-MS publicados para Parkin43, provavelmente devido a diferenças entre linhas celulares e fluxos de trabalho de proteômica.Além de quatro proteínas conhecidas (ARDM1, HSPA8, PSMD14 e PSMC3) identificadas por dois métodos (Fig. 5c)43.Para validar ainda mais os resultados de LC-MS/MS, o tratamento com PDPL e o Western blotting subsequente foram usados ​​para comparar os resultados do ensaio de células-mãe HEK293T e a linha parkin N-terminal estável.Alvos previamente desconhecidos CDK2, DUT, CTBP1 e PSMC4 foram testados com um ligante conhecido, DNAJB1 (Fig. 5d).
Gráfico de vulcão de proteínas que interagem com parkin em células HEK293T com miniSOG expresso de forma estável fundida ao terminal N ou C de parkin (n = 3 experimentos biológicos independentes).O teste t de Student bicaudal foi usado em gráficos de vulcões.HEK293T foi usado como controle negativo. Proteínas significativamente alteradas estão destacadas em vermelho (p < 0,05 e >2 vezes a diferença de intensidade de íons). Proteínas significativamente alteradas estão destacadas em vermelho (p < 0,05 e >2 vezes a diferença de intensidade de íons). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ион интенсивности ). As proteínas significativamente alteradas estão destacadas em vermelho (p < 0,05 e >2 vezes a diferença na intensidade do íon).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). As proteínas significativamente alteradas estão destacadas em vermelho (p < 0,05 e > 2 vezes a diferença na força iônica).Proteínas relacionadas importantes para HEK293T-miniSOG, mas não importantes para HEK293T, são mostradas em verde.b Diagrama de Venn mostrando proteínas sobrepostas entre as construções N-terminal e C-terminal.As etiquetas N-terminais podem ativar de forma aberrante a parkina e resultar em proteínas mais reconhecíveis.c Diagrama de Venn mostrando proteínas sobrepostas entre PDPL e AP-MS.Os interagentes conhecidos estão listados, incluindo 4 das 18 proteínas sobrepostas e 11 das 159 proteínas identificadas especificamente no PDPL.d Os alvos representativos identificados por LC-MS/MS foram verificados por Western blotting.e Ssu72 e SNW1 foram identificados como substratos de parkin não registrados.Estes plasmídeos de proteína marcados com FLAG foram transfectados em HEK293T e HEK293T-Parkin-miniSOG seguido de tratamento com CCCP em vários pontos de tempo.A degradação foi mais pronunciada na linha de superexpressão de Parkin.f Usando o inibidor de proteassoma MG132, foi confirmado que o processo de degradação de Ssu72 e SNW1 é mediado por proteassoma-ubiquitinação.Esses experimentos foram repetidos independentemente pelo menos duas vezes com resultados semelhantes.Os dados brutos são fornecidos na forma de arquivos de dados brutos.
Notavelmente, as proteínas identificadas por PDPL devem incluir proteínas de ligação a parkin e seus substratos.Para detectar substratos de parkin não registrados, selecionamos sete proteínas identificadas (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 e SNW1) e plasmídeos transfectados para expor esses genes a HEK293T normal e expressar de forma estável HEK293T de miniSOG-Parkin seguido de tratamento com CCCP.Os níveis de proteínas Ssu72 e SNW1 foram significativamente reduzidos na linha estável miniSOG-Parkin (Fig. 5e).O tratamento com CCCP por 12 horas resultou na degradação mais significativa de ambos os substratos.Para investigar se a degradação de Ssu72 e SNW1 é regulada por ubiquitinação de proteassoma, o inibidor de proteassoma MG132 foi adicionado para inibir a atividade do proteassoma e, de fato, descobrimos que seu processo de degradação foi inibido (Fig. 5f).Alvos não substratos adicionais foram confirmados como interagentes de Parkina usando Western blotting (Fig. 10 suplementar), que mostrou resultados consistentes com LC-MS/MS.Em conclusão, a integração do fluxo de trabalho PDPL com verificação de transfecção de proteína alvo permite a identificação de substratos de ligase E3 não registrados.
Desenvolvemos uma plataforma comum de marcação de proximidade que permite identificar POIs que interagem no espaço e no tempo.A plataforma é baseada na proteína fotossensibilizadora miniSOG, que tem apenas cerca de 12 kDa, menos da metade do tamanho da enzima APEX2 madura (27 kDa) e um terço do tamanho do TurboID (35 kDa).O tamanho menor deve expandir muito a gama de aplicações para o estudo de pequenos interactomas de proteínas.A exploração adicional de fotossensibilizadores adicionais, sejam proteínas geneticamente codificadas ou pequenas moléculas, é necessária para aumentar o rendimento quântico de oxigênio singlete e expandir a sensibilidade dessa abordagem.Para a versão atual do miniSOG, a alta resolução temporal pode ser alcançada usando iluminação azul para ativar marcadores de proximidade.Além disso, o tempo de exposição mais longo liberou uma “nuvem” maior de oxigênio singlete, resultando na modificação de resíduos de histidina mais distais, raio de marcação aumentado e capacidade de ajustar a resolução espacial do PDPL.Também testamos sete sondas químicas para aumentar a relação sinal-fundo e exploramos o mecanismo molecular por trás dessa abordagem.O fluxo de trabalho TOP-ABPP combinado com pesquisa aberta imparcial confirmou que as modificações ocorreram apenas em histidinas e nenhum microambiente consistente foi observado para modificações de histidina aumentadas, exceto por uma preferência moderada por histidinas na região do loop.
PDPL também foi usado para caracterizar proteomas subcelulares com especificidade de proteoma e cobertura pelo menos comparável a outros métodos de marcação de proximidade e sonda química específica de organela.Marcadores de proximidade também têm sido usados ​​com sucesso para caracterizar os proteomas de superfície, lisossômicos e associados ao secretoma46,47.Acreditamos que PDPL será compatível com essas organelas subcelulares.Além disso, desafiamos o PDPL identificando alvos para a ligação de proteínas citosólicas que são mais complexas do que as proteínas ligadas à membrana devido às suas propriedades dinâmicas e envolvimento em interações mais temporais.O PDPL foi aplicado a duas proteínas, o coativador transcricional BRD4 e a ligase E3 Parkin associada à doença.Estas duas proteínas foram escolhidas não só pelas suas funções biológicas fundamentais, mas também pela sua relevância clínica e potencial terapêutico.Para esses dois POIs, foram identificados parceiros de ligação bem conhecidos, bem como alvos não registrados.Notavelmente, a proteína SFPQ associada à separação de fases foi confirmada por co-IP, o que pode indicar um novo mecanismo pelo qual BRD4 (short isoform) regula LLPS.Ao mesmo tempo, acreditamos que a identificação de substratos de Parkin é um cenário em que a identificação de adesivos indiretos é necessária.Identificamos dois substratos de parkin não identificados e confirmamos sua degradação ao longo da via de ubiquitinação-proteassoma.Recentemente, uma estratégia de captura baseada em mecanismo foi desenvolvida para detectar substratos de hidrolase prendendo-os com enzimas.Embora este seja um método muito poderoso, não é adequado para a análise de substratos envolvidos na formação de grandes complexos e requer a formação de ligações covalentes entre a enzima e o substrato.Esperamos que o PDPL possa ser estendido para estudar outros complexos de proteínas e famílias de enzimas, como as famílias deubiquitinase e metaloprotease.
Uma nova forma de miniSOG, chamada SOPP3, foi desenvolvida com melhor produção de oxigênio singlete.Comparamos o miniSOG com o SOPP3 e encontramos um desempenho de marcação aprimorado, embora a relação sinal-ruído tenha permanecido inalterada (Fig. 11 suplementar).Nós hipotetizamos que a otimização de SOPP3 (por exemplo, através de evolução direcionada) levaria a proteínas fotossensibilizadoras mais eficientes que requerem tempos de luz mais curtos e, assim, permitem que processos celulares mais dinâmicos sejam capturados.Notavelmente, a versão atual do PDPL é limitada ao ambiente celular, pois requer iluminação com luz azul e não pode penetrar nos tecidos profundos.Esse recurso impede seu uso em estudos de modelos animais.No entanto, a combinação de optogenética com PDPL pode oferecer uma oportunidade para pesquisas com animais, especialmente no cérebro.Além disso, outros fotossensibilizadores infravermelhos projetados também removem essa limitação.A pesquisa está atualmente em andamento nesta área.
A linha celular HEK293T foi obtida de ATCC (CRL-3216).A linhagem celular foi negativa para infecção por micoplasma e foi cultivada em DMEM (Thermo, #C11995500BT) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Vistech, #SE100-B) e 1% de penicilina/estreptomicina (Hyclone, #SV30010).Crescido em.
O 3-aminofenileno (amostra 3) e (4-etinilfenil)metanamina (amostra 4) foram adquiridos à Bidepharm.A propilamina (sonda 2) foi adquirida da Energy-chemicals.N-(2-Aminofenil)pent-4-inamida (sonda 1) foi sintetizada de acordo com métodos publicados.
A Tabela Suplementar 1 lista as construções genéticas usadas neste estudo.As sequências miniSOG e KillerRed foram clonadas a partir de um plasmídeo presente de P. Zou (Universidade de Pequim).A sequência de direcionamento da matriz mitocondrial foi derivada dos 23 aminoácidos N-terminais de COX4 e clonada nos vetores indicados usando um conjunto Gibson (Beyotime, #D7010S).Para atingir a membrana e o núcleo do retículo endoplasmático, DNA humano SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) amplificado por PCR de uma biblioteca de cDNA de células HEK293T e DNA H2B (doado por D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) e clonado, como mencionado acima.Salvo indicação em contrário, outros genes de proteínas usados ​​para transfecção e construção de linhas celulares estáveis ​​foram amplificados por PCR a partir da biblioteca de cDNA de células HEK293T.G3S (GGGS) e G4S (GGGGS) foram usados ​​como ligantes entre a proteína isca e a miniSOG.Um marcador de epítopo V5 (GKPIPNPLLGLDST) foi adicionado a esses construtos de fusão.Para expressão em mamíferos e para estabelecer uma linha celular estável, o construto de fusão miniSOG foi subclonado no vetor lentiviral pLX304.Para expressão bacteriana, o miniSOG foi clonado no vetor pET21a marcado 6xHis no terminal C.
As células HEK293T foram semeadas a 2,0 x 105 células por poço em placas de seis poços e transfectadas 24 horas depois com plasmídeos lentivirais recombinantes (2,4 μg pLX304) e plasmídeos de empacotamento viral (1,5 μg psPAX2 e 1,2 μg pMD2.G) com o uso de Lipo8000 (Beyotime , #C0533), cerca de 80% de fusão.Após transfecção durante a noite, o meio foi trocado e incubado por mais 24 horas.A coleta do vírus foi realizada após 24, 48 e 72 horas.Antes da infecção das linhagens celulares alvo, o meio viral foi filtrado através de um filtro de 0,8 μm (Merck, #millex-GP) e polibreno (Solarbio, #H8761) foi adicionado a uma concentração de 8 μg/ml.Após 24 horas, as células foram deixadas se recuperar mudando o meio.As células foram selecionadas usando 5 μg/ml de blasticidina (Solarbio, #3513-03-9) para as três primeiras passagens como uma seleção menos rigorosa.Em seguida, usou 20 μg/ml como um regime mais rigoroso para as próximas três passagens.
As células foram semeadas em câmaras de 12 poços (Ibidi, #81201) a uma densidade de aproximadamente 20.000 células por poço.Para melhorar a adesão de células HEK293T, adicione 50 µg/ml de fibronectina (Corning, #356008) diluída em solução salina tamponada com fosfato (PBS, Sangon, #B640435) a 37°C.As câmaras foram pré-tratadas por 1 hora e depois removidas com PBS.Após 24 h, as células foram lavadas uma vez com PBS, incubadas com 1 mM de sonda 3 em solução salina balanceada de Hanks fresca (HBSS, Gibco, #14025092) por 1 h a 37°C e depois incubadas com um LED azul (460 nm ).) foram irradiados por 10 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas com formaldeído a 4% em PBS (Sangon, #E672002) por 15 minutos em temperatura ambiente.O excesso de formaldeído foi removido das células fixadas por lavagem três vezes com PBS.As células foram então permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sangon, #A600198) em PBS e lavadas 3 vezes com PBS.Em seguida, remova a câmara e adicione a cada amostra 25 µl de uma mistura de reação de clique contendo 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) e 0,5 mg/ml de ascorbato de sódio (Aladdin, no. S105024) e incubado durante 30 minutos à temperatura ambiente.Após uma reação instantânea, as células foram lavadas seis vezes com PBS contendo 0,05% de Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) e depois bloqueadas com 5% de BSA (Abcone, #B24726) em PBST por 30 minutos à temperatura ambiente.
Para imunocoloração de colocalização, as células foram incubadas com anticorpos primários de acordo com as condições indicadas: mAb anti-V5 de camundongo (1:500, CST, #80076), mAb anti-Hsp60 de coelho (1:1000), ABclonal, #A0564), anticorpo policlonal anti-calnexina de coelho (1:500, Abcam, #ab22595) ou anticorpo monoclonal anti-lamina A/C de coelho (1:500; CST, #2032) a 4°C durante a noite.Após lavagem 3 vezes com PBST, as células foram incubadas com anticorpos secundários: cabra anti-coelho Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) diluída a 1:1000, cabra anti-rato Alexa Fluor 594 (CST, #8889) diluída a 1:1000.diluição Diluir à temperatura ambiente durante 30 minutos.As células foram então lavadas 3 vezes com PBST e contrastadas com DAPI (Thermo, #D1306) em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente.Após 3 lavagens com PBS, as células foram seladas em 50% de glicerol (Sangon, #A600232) em PBS para geração de imagens.As imagens de imunofluorescência foram obtidas usando um microscópio confocal ZEISS LSM 900 Airyscan2 e software ZNE 3.5.
Para imagens fluorescentes de oxigênio singlete, as células foram lavadas duas vezes com tampão Hanks HEPES antes de adicionar Si-DMA 100 nM em tampão Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Após exposição à luz, as células foram incubadas em incubadora de CO2 a 37°C por 45 minutos.As células foram então lavadas duas vezes com tampão HEPES de Hanks e contrastadas com Hoechst em tampão HEPES de Hanks durante 10 minutos à temperatura ambiente e visualizadas utilizando um microscópio confocal ZEISS LSM 900., #M36008) em tampão HBSS contendo cálcio e magnésio.Após exposição à luz ou doxorrubicina (MCE, #HY-15142A), as células foram incubadas em uma incubadora de CO2 a 37°C por 10 minutos, lavadas duas vezes com tampão HBSS e incubadas com Hoechst em tampão HBSS à temperatura ambiente.minutos.A doxorrubicina foi usada como um controle de sonda positivo onde as células foram tratadas com 20 μM de doxorrubicina em HBSS contendo 1% de BSA por 30 min.As imagens de imunofluorescência foram obtidas usando um microscópio confocal Zeiss LSM 900.
As células HEK293T expressando de forma estável mito-miniSOG foram semeadas a uma densidade de aproximadamente 30% em placas de 15 cm.Após 48 horas, quando ~80% de confluência foi atingida, as células foram lavadas uma vez com PBS, incubadas com 1 mM de Sonda 3 em tampão HBSS fresco por 1 hora a 37°C e depois iluminadas com um LED azul por 10 minutos em ambiente temperatura..Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS, raspadas e ressuspensas em tampão PBS gelado contendo inibidores de protease sem EDTA (MCE, #HY-K0011).As células foram lisadas por sonicação da ponta por 1 minuto (1 segundo ligado e 1 segundo desligado a 35% de amplitude).A mistura resultante foi centrifugada a 15.871 xg por 10 min a 4°C para remover detritos e a concentração do sobrenadante foi ajustada para 4 mg/mL usando um kit de ensaio de proteína BCA (Beyotime, #P0009).Combine 1 ml do lisado acima com 0,1 mM de azida de biotina fotodegradável (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM de ligante TBTA (Aladdin, #T162437) e 1 mM de CuSO4 incubadora com fundo rotação por 1 hora em temperatura ambiente.Após uma reação rápida, adicione a mistura à solução pré-misturada (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) em um frasco de vidro de 10 ml.As amostras foram misturadas e centrifugadas a 4500 g por 10 minutos em temperatura ambiente.As soluções inferior e superior foram descartadas, o precipitado foi lavado duas vezes com 1 ml de metanol e centrifugado a 15871×g por 5 min a 4°C.Adicionar 1 ml de ureia 8 M (Aladdin, n.º U111902) em bicarbonato de amónio 25 mM (ABC, Aladdin, n.º A110539) para dissolver o precipitado.As amostras foram reconstituídas com 10 mM de ditiotreitol (Sangon, #A100281 em 25 mM ABC) por 40 minutos a 55°C seguido pela adição de 15 mM de iodoacetamida fresca (Sangon, #A600539) à temperatura ambiente no escuro.Alquilação em 30 minutos..Adicionou-se mais ditiotreitol 5 mM para parar a reacção.Prepare aproximadamente 100 µl de esferas de agarose NeutrAvidin (Thermo, #29202) para cada amostra lavando 3 vezes com 1 ml de PBS.A solução de proteoma acima foi diluída com 5 ml de PBS e incubada com contas de agarose NeutrAvidin pré-lavadas durante 4 horas à temperatura ambiente.As esferas foram então lavadas 3 vezes com 5 ml de PBS contendo 0,2% de SDS (Sangon, #A600485), 3 vezes com 5 ml de PBS contendo ureia 1M e 3 vezes com 5 ml de ddH2O.As esferas foram então colhidas por centrifugação e ressuspensas em 200 μl de 25 mM ABC contendo 1 M de ureia, 1 mM de CaCl 2 (Macklin, #C805228) e 20 ng/μl de tripsina (Promega, #V5280).Trypsinize durante a noite a 37 ° C com rotação.A reação foi interrompida pela adição de ácido fórmico (Thermo, # A117-50) até o pH atingir 2-3.As esferas foram lavadas 3 vezes com 1 ml de PBS contendo SDS a 0,2%, 3 vezes com 1 ml de PBS contendo 1 M de ureia e depois 3 vezes com 1 ml de água destilada.Os peptídeos modificados foram liberados por lise leve (365 nm) por 90 min usando 200 μl de 70% MeOH.Após centrifugação, o sobrenadante foi recolhido.As contas foram então lavadas uma vez com 100 μl de 70% MeOH e os sobrenadantes foram reunidos.As amostras foram secas em um concentrador de vácuo Speedvac e armazenadas a -20°C até a análise.
Para identificar e quantificar peptídeos modificados por oxigênio singlete, as amostras foram redissolvidas em ácido fórmico a 0,1% e 1 μg de peptídeos foram analisados ​​usando um espectrômetro de massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid equipado com uma fonte nano ESI da Tune e Xcalibur do software do fornecedor 4.3.As amostras foram separadas em uma coluna capilar empacotada internamente de 75 µm × 15 cm com material C18 de 3 µm (ReproSil-pur, #r13.b9.) e conectadas a um sistema EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Os peptídeos foram separados por cromatografia de gradiente linear de 95 minutos de 8% de solvente B a 50% de solvente B (A = 0,1% de ácido fórmico em água, B = 0,1% de ácido fórmico em 80% de acetonitrila), depois aumentou linearmente para 98% B min em 6 min a uma taxa de fluxo de 300 nl/min.O Orbitrap Fusion Lumos coleta dados alternadamente entre a varredura completa do MS e a varredura do MS2, dependendo dos dados.A tensão de pulverização foi ajustada para 2,1 kV e a temperatura do capilar de transporte de íons foi de 320°C.Os espectros de MS (350-2000 m/z) foram coletados com uma resolução de 120.000, AGC 4 × 105 e um tempo máximo de entrada de 150 ms.Os 10 precursores de carga múltipla mais comuns em cada varredura completa foram fragmentados usando HCD com uma energia de colisão normalizada de 30%, uma janela de isolamento de quadrupolo de 1,6 m/z e uma configuração de resolução de 30.000.Um alvo AGC para espectrometria de massa em tandem usando 5×104 e tempo máximo de entrada de 150 ms.A exceção dinâmica é definida como 30 segundos. Íons não atribuídos ou aqueles com carga de 1+ e >7+ foram rejeitados para MS/MS. Íons não atribuídos ou aqueles com carga de 1+ e >7+ foram rejeitados para MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Íons não atribuídos ou íons com carga de 1+ e >7+ foram rejeitados para MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Íons não especificados ou íons com cargas de 1+ e >7+ foram rejeitados para MS/MS.
Os dados brutos são processados ​​usando a plataforma de computação FragPipe baseada em MSFragger.Os desvios de massa e os aminoácidos correspondentes foram determinados usando um algoritmo de busca aberta com uma tolerância de massa de precursor de -150 a 500 Da.Peptídeos modificados foram então identificados usando modificações de histidina com ganhos de massa de +229,0964 e +247,1069 Da em PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
As células que expressam de forma estável o gene miniSOG fundido foram plaqueadas em placas de 6 cm.Ao atingir ~80% de confluência, as células foram lavadas uma vez com HBSS (Gibco, #14025092), depois incubadas com sondas químicas em HBSS por 1 hora a 37°C e iluminadas com luz azul.LED de 10W por 20 minutos em temperatura ambiente.Para determinar qual tipo de espécie reativa de oxigênio está envolvida no PDPL, 0,5 mM de vitamina C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM de manitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM de H2O2, 10 mM de NaN3 foram adicionados às células como suplementos.Após a lavagem com PBS frio, as células foram raspadas, coletadas em tubos de centrífuga de 1,5 ml e sonicadas com uma ponta por 1 min em 200 μl de PBS com 1x inibidor de protease sem EDTA (1 s e 1 s sem, amplitude 35%).A mistura resultante foi centrifugada a 15.871 × g por 10 min a 4°C e a concentração do sobrenadante foi ajustada para 1 mg/mL usando um kit de ensaio de proteína BCA.Aproximadamente 50 µl do lisado acima foi incubado com 0,1 mM de azida de rodamina (Aladdin, nº T131368), 1 mM de TCEP, 0,1 mM de ligante de TBTA e 1 mM de CuSO4 por 1 hora à temperatura ambiente com rotação de baixo para cima.Após a reação de clique, a precipitação com acetona foi realizada adicionando 250 μl de acetona pré-resfriada às amostras, incubando a -20°C por 20 min e centrifugando a 6010×g por 10 min a 4°C.Recolher o pellet e ferver em 50 µl de 1x tampão de Laemmli por 10 min a 95 ° C.As amostras foram então analisadas em géis longos SDS-PAGE e visualizadas usando o sistema de imagem Bio-rad ChemiDoc MP Touch com o software Image Lab Touch.
A expressão e purificação da proteína recombinante miniSOG-6xHis foi realizada como descrito anteriormente.Resumidamente, células de E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) foram transformadas com pET21a-miniSOG-6xHis e a expressão da proteína foi induzida com IPTG 0,5 mM (Sangon, #A600168).Após a lise celular, as proteínas foram purificadas usando esferas de agarose Ni-NTA (MCE, nº 70666), dialisadas contra PBS e armazenadas a -80°C.
Para um ensaio de proximidade de rótulo in vitro baseado em anticorpos, misture 100 μM de miniSOG purificado, 1 mM de sonda 3 e 1 μg de anticorpo monoclonal de camundongo anti-rótulo (TransGen, #HT501-01) em PBS para um volume total de reação de 50 μl..A mistura de reação foi irradiada com luz LED azul por 0, 2, 5, 10 e 20 min à temperatura ambiente.A mistura foi incubada com 0,1 mM de biotina-PEG3-azida (Aladdin, #B122225), 1 mM de TCEP, 0,1 mM de ligante de TBTA e 1 mM de CuSO4 por 1 h à temperatura ambiente em um agitador de movimento ascendente.Após uma reação instantânea, adicione 4x tampão de Laemmli diretamente à mistura e ferva a 95 ° C por 10 min.As amostras foram analisadas em géis SDS-PAGE e analisadas por Western blotting com estreptavidina-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Um peptídeo sintético contendo histidina com amidação C-terminal (LHDALDAK-CONH2) foi usado para analisar a marcação in vitro baseada em peptídeo próximo.Neste ensaio, 100 μM de miniSOG purificado, 10 mM de sonda 3 e 2 μg/ml de peptídeo sintético foram misturados em PBS em um volume total de reação de 50 μl.A mistura reaccional foi irradiada com luz LED azul durante 1 hora à temperatura ambiente.Um microlitro de amostra foi analisado usando um sistema LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight espectrômetro de massa com software de análise de espectro MassLynx).
As células HEK293T expressando de forma estável o gene de fusão miniSOG foram semeadas em placas de 10 cm para linhas com diferentes localização de organelas (Mito, ER, Núcleo) e placas de 15 cm para as linhas Parkin-miniSOG e BRD4-miniSOG.Ao atingir ~90% de confluência, as células foram lavadas uma vez com HBSS, depois incubadas com a sonda 3 em HBSS por 1 hora a 37°C e iluminadas com um LED azul de 10 W à temperatura ambiente.Para marcação sem contato de Parkin, 10 µM de transportador de cianeto de carbonil próton m-clorofenilhidrazona CCCP (Solarbio, #C6700) com sonda 3 em HBSS foi adicionado durante 1 hora a 37°C.As etapas de lise celular, química de clique, redução e alquilação foram as mesmas descritas acima, exceto que 2 mg de lisado foram adicionados e azida de biotina PEG3 foi usada na reação de clique em vez de azida de biotina fotodegradável.Após o enriquecimento, as esferas foram lavadas 3 vezes com 5 ml de PBS contendo 0,2% SDS, 3 vezes com 5 ml de PBS contendo 1 M de ureia e 3 vezes com 5 ml de PBS.Em seguida, adicionaram-se 2 µg de tripsina a 300 µl de ABC 25 mM contendo ureia 1 M para clivar a proteína durante a noite a 37°C.A reação foi interrompida pela adição de ácido fórmico até que um pH de 2-3 fosse alcançado.Após tripsinização em esferas, a solução peptídica foi dessalinizada usando uma coluna SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) e seca em um concentrador a vácuo Speedvac.Os peptídeos foram redissolvidos em ácido fórmico a 0,1% e 500 ng de peptídeos foram analisados ​​usando um espectrômetro de massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid equipado com a fonte nano-ESI descrita acima.Os peptídeos foram separados em pré-colunas RP-HPLC comerciais (75 μm x 2 cm) (Thermo, nº 164946) e colunas analíticas RP-HPLC (75 μm x 25 cm) (Thermo, nº 164941), ambas preenchidas com 2 μm.gradiente de 8% a 35% ACN em 60 minutos, depois aumentou linearmente para 98% B em 6 minutos a uma taxa de fluxo de 300 Nl/min.Os espectros de MS (350-1500 m/z) foram coletados com uma resolução de 60.000, AGC 4 × 105 e um tempo máximo de entrada de 50 ms.Os íons selecionados foram fragmentados sequencialmente por HCD em ciclos de 3 s com uma energia de colisão normalizada de 30%, uma janela de isolamento de quadrupolo de 1,6 m/z e uma resolução de 15.000. Um alvo AGC de espectrômetro de massa em tandem de 5 × 104 e um tempo máximo de injeção de 22 ms.A exclusão dinâmica é definida para 45 segundos. Íons não atribuídos ou aqueles com carga de 1+ e >7+ foram rejeitados para MS/MS. Íons não atribuídos ou aqueles com carga de 1+ e >7+ foram rejeitados para MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Íons não atribuídos ou íons com carga de 1+ e >7+ foram rejeitados para MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Íons não especificados ou íons com cargas de 1+ e >7+ foram rejeitados para MS/MS.
As etapas de preparação da amostra até o enriquecimento das esferas NeutrAvidin foram as mesmas da análise LC-MS/MS descrita acima.Aproximadamente 50 μg de lisado foram usados ​​como entrada para controle de carga e 2 mg de lisado foram usados ​​para reações de clique.Após enriquecimento e lavagem com neutravidina, as proteínas ligadas foram eluídas pela adição de 50 μl de tampão de Laemmli às esferas de resina de agarose e fervura a 95°C por 5 minutos.A entrada de carga de controle e as amostras enriquecidas com grânulos foram analisadas por SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF (Millipore, #ISEQ00010) por métodos padrão de Western blot.As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado (Sangon, #A600669) em TBS contendo 0,1% de tween-20 (TBST) e incubadas sequencialmente com anticorpos primários e secundários.Os anticorpos primários foram diluídos 1:1000 em leite desnatado a 5% em TBST e incubados durante a noite a 4°C.Anticorpos secundários foram usados ​​na proporção de 1:5000 e incubados por 1 hora em temperatura ambiente.As membranas foram visualizadas por quimioluminescência usando o sistema de imagem Chemidoc MP.Todas as varreduras sem cortes de manchas e géis na figura são apresentadas como dados brutos.
Os anticorpos primários utilizados neste estudo incluíram anticorpo monoclonal anti-SFPQ de coelho (CST, nº 71992), anticorpo monoclonal anti-FUS de coelho (CST, nº 67840), anticorpo policlonal anti-NSUN2 de coelho (Proteintech, nº 20854-1- AP), anticorpo policlonal anti-mSin3A de coelho (Abcam, #ab3479), anticorpo monoclonal anti-tag de camundongo (TransGen, #HT201-02), anticorpo monoclonal anti-β-actina de camundongo (TransGen, #HC201-01), anticorpo monoclonal anti-β-actina de camundongo (TransGen, #HC201-01), -anticorpo monoclonal CDK2 (ABclonal, #A0094), anticorpo monoclonal de coelho para CTBP1 (ABclonal, #A11600), anticorpo policlonal de coelho para DUT (ABclonal, #A2901), anticorpo policlonal de coelho para PSMC4 (ABclonal, #A2505), anticorpo anti- Anticorpo policlonal DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Esses anticorpos foram usados ​​na diluição de 1:1000 em leite desnatado a 5% em TBST.Os anticorpos secundários usados ​​neste estudo incluíram IgG anti-coelho (TransGen, #HS101-01), IgG anti-camundongo (TransGen, #HS201-01) em uma diluição de 1:5000.
Para investigar ainda mais se BRD4 interage com SFPQ, células estáveis ​​HEK293T e BRD4-miniSOG superexpressando HEK293T foram plaqueadas em placas de 10 cm.As células foram lavadas com PBS frio e lisadas em 1 ml de tampão de lise Pierce IP (Thermo Fisher, #87787) com inibidor de protease sem EDTA durante 30 minutos a 4°C.Em seguida, os lisados ​​foram coletados em tubos de centrífuga de 1,5 ml e centrifugados a 15.871 xg por 10 min a 4°C.O sobrenadante foi colhido e incubado com 5 µg de anticorpo monoclonal de camundongo marcado anti-V5 (CST, #80076) durante a noite a 4°C.Lave aproximadamente 50 µl de esferas magnéticas de proteína A/G (MCE, #HY-K0202) duas vezes com PBS contendo 0,5% de Tween-20.Em seguida, os lisados ​​celulares foram incubados com esferas magnéticas por 4 horas a 4°C com rotação de baixo para cima.Em seguida, as esferas foram lavadas quatro vezes com 1 ml de tampão PBST e fervidas a 95°C por 5 min.As amostras foram analisadas em géis SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF usando métodos padrão de Western blot.As membranas foram bloqueadas em leite desnatado a 5% em TBST e incubadas sequencialmente com anticorpos primários e secundários.Anticorpo primário de coelho anti-SFPQ anticorpo monoclonal (CST, #71992) foi usado na proporção de 1:1000 em 5% de leite desnatado em TBST e incubado durante a noite a 4°C.IgG anti-coelho foi usado na proporção de 1:5000 e incubado por 1 hora em temperatura ambiente.As membranas foram visualizadas por quimioluminescência usando o sistema de imagem Chemidoc MP.
Todas as estruturas utilizadas para a análise da Área de Superfície Acessível ao Solvente (SASA) foram obtidas do Protein Data Bank (PDB)52 ou do AlphaFold Protein Structure Database53.O SASA absoluto foi calculado para cada resíduo usando o programa FreeSASA.Apenas dados SASA completos e inequívocos para histidina marcada e seus vizinhos foram usados ​​para obter a SASA média para cada estrutura.A acessibilidade relativa ao solvente (RSA) para cada histidina foi calculada dividindo o valor absoluto de SASA pela área de superfície residual máxima possível empírica disponível para o solvente.Todas as histidinas foram então classificadas como ocultas se a RSA média fosse inferior a 20%, caso contrário expostas56.
Arquivos brutos obtidos no modo DDA foram pesquisados ​​usando Proteome Discoverer (v2.5) ou MSfragger (Fragpipe v15.0) no banco de dados de proteínas verificado SwissProt apropriado contendo contaminantes comuns.Os peptídeos requeriam tripsina completa com dois sítios de clivagem ausentes, metilação de carbamoil como uma modificação fixa e oxidação de metionina como uma modificação dinâmica.As tolerâncias de peso do precursor e fragmento foram definidas para 10 ppm e 0,02 Da (MS2 Orbitrap), respectivamente. Os acertos de contaminantes foram removidos e as proteínas foram filtradas para obter uma taxa de descoberta falsa de <1%. Os acertos de contaminantes foram removidos e as proteínas foram filtradas para obter uma taxa de descoberta falsa de <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного обнаружения <1%. Os acertos contaminantes foram removidos e as proteínas filtradas para fornecer uma taxa de detecção falsa de <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания з з з зрззющ "в ащщ ыыыыызющfiaх а ащщщ аыыыы аыыы а ыыыыы аыыыыыыыыыыыыы ns зыы а а а а а а аеи а а а аеи а а а и а а а и а а а A аеиффillф а а а а а а а ифillи а%а а а а а ифillи а%а а а а а а а ифillф а ае а а а а а а а ифillф а ае а а ащ а а ащыы азющ па пазщ п пазщ а пр зрыы з peso Os acertos contaminantes foram removidos e as proteínas filtradas para atingir uma taxa de falsos positivos de <1%.Para análise quantitativa sem o uso de marcadores, foi utilizado o teor de proteína normalizado de três repetições biológicas.A análise de localização subcelular de proteínas foi realizada usando análise Gene Ontology (GO) de DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 e bancos de dados compilados e publicados pelo grupo Alice Ting.O mapa do vulcão foi obtido de Perseus (v1.6.15.0). As alterações de dobras de abundância de proteína foram testadas quanto à significância estatística usando um teste t de dois lados, e os acertos de proteína foram identificados com alteração de abundância > 2 (a menos que indicado de outra forma) e valor p <0,05. As alterações de dobras de abundância de proteína foram testadas quanto à significância estatística usando um teste t de dois lados, e os acertos de proteína foram identificados com alteração de abundância > 2 (a menos que indicado de outra forma) e valor p <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. As alterações do conteúdo de proteína foram testadas quanto à significância estatística usando um teste t bicaudal, e as correspondências de proteína foram identificadas com alteração de conteúdo > 2 (a menos que indicado de outra forma) e valor de p <0,05.使用 双边 t 检验 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 蛋白质 命 命 中 的 变化> 2 （除非 另 说明 说明） 和 p 值 <0,05。使用 双边 t 检验 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 中 中 的 变化> 2 （另 有 说明） 和 p 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. A significância estatística das alterações de dobra no teor de proteína foi testada usando um teste t bicaudal, e as correspondências de proteína foram determinadas para alterações de conteúdo > 2 (a menos que indicado de outra forma) e valores p <0,05.A análise de interação de proteínas foi realizada usando a análise GO juntamente com o banco de dados String.
Três réplicas biológicas foram realizadas com resultados semelhantes.A análise estatística foi feita com GraphPad Prism (software GraphPad) e gráficos de vulcões foram gerados com Perseus (v1.6.15.0).Para comparar os dois grupos, os valores de p foram determinados usando um teste t de Student bicaudal.Apenas proteínas singleton identificadas pelo menos duas vezes no grupo experimental foram incluídas nas parcelas do vulcão, e os valores ausentes correspondentes no grupo controle foram substituídos por Perseus de uma distribuição normal para que o valor p pudesse ser calculado.As barras de erro representam a média ± desvio padrão.Nas análises proteômicas para análise estatística, a abundância de proteínas que apareceram em pelo menos duas réplicas biológicas foi mantida.Não foram utilizados métodos estatísticos para pré-determinar o tamanho da amostra.Os experimentos não são aleatórios.Os pesquisadores não ficaram cegos para as tarefas durante o experimento e avaliação dos resultados.
Para obter mais informações sobre o desenho do estudo, consulte o resumo do Nature Research Report vinculado a este artigo.
Os dados de espectrometria de massa obtidos neste estudo foram submetidos ao ProteomeXchange Consortium através do repositório do parceiro iProX57 sob o ID do conjunto de dados PXD034811 (conjunto de dados PDPL-MS).Os dados brutos são fornecidos na forma de arquivos de dados brutos.Este artigo fornece os dados originais.
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