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Os fotossensibilizadores eficazes são especialmente importantes para o amplo uso clínico da fototerapia.No entanto, os fotossensibilizadores convencionais geralmente sofrem de absorção de comprimento de onda curto, fotoestabilidade insuficiente, baixo rendimento quântico de espécies reativas de oxigênio (ROS) e extinção de ROS induzida por agregação.Aqui nós relatamos um fotossensibilizador supramolecular (RuDA) de infravermelho próximo (NIR) mediado pela auto-montagem de complexos organometálicos Ru(II)-areno em solução aquosa.O RuDA só pode gerar oxigênio singleto (1O2) no estado agregado e exibe um comportamento óbvio de geração de 1O2 induzido por agregação devido a um aumento significativo no processo de cruzamento entre o sistema singleto-tripleto.Sob a ação da luz laser de 808 nm, o RuDA exibe um rendimento quântico de 1O2 de 16,4% (verde de indocianina aprovado pela FDA: ΦΔ = 0,2%) e uma alta eficiência de conversão fototérmica de 24,2% (nanobastões de ouro comerciais) com excelente fotoestabilidade.: 21,0%, nanoconchas de ouro: 13,0%).Além disso, RuDA-NPs com boa biocompatibilidade podem se acumular preferencialmente em sítios tumorais, causando regressão tumoral significativa durante a terapia fotodinâmica com redução de 95,2% no volume tumoral in vivo.Esta terapia fotodinâmica de aumento de agregação fornece uma estratégia para o desenvolvimento de fotossensibilizadores com propriedades fotofísicas e fotoquímicas favoráveis.
Comparada à terapia convencional, a terapia fotodinâmica (TFD) é um tratamento atraente para o câncer devido às suas vantagens significativas, como controle espaço-temporal preciso, não invasividade, resistência desprezível aos medicamentos e minimização dos efeitos colaterais 1,2,3.Sob irradiação de luz, os fotossensibilizadores utilizados podem ser ativados para formar espécies altamente reativas de oxigênio (ROS), levando a apoptose/necrose ou respostas imunes4,5. No entanto, a maioria dos fotossensibilizadores convencionais, como clorinas, porfirinas e antraquinonas, têm absorção de comprimento de onda relativamente curto (frequência < 680 nm), resultando em baixa penetração de luz devido à intensa absorção de moléculas biológicas (por exemplo, hemoglobina e melanina) em a região do visível6,7. No entanto, a maioria dos fotossensibilizadores convencionais, como clorinas, porfirinas e antraquinonas, têm absorção de comprimento de onda relativamente curto (frequência < 680 nm), resultando em baixa penetração de luz devido à intensa absorção de moléculas biológicas (por exemplo, hemoglobina e melanina) em a região do visível6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. No entanto, os fotossensibilizadores mais comuns, como clorinas, porfirinas e antraquinonas, têm absorção de comprimento de onda relativamente curto (< 680 nm), resultando em baixa penetração de luz devido à intensa absorção de moléculas biológicas (por exemplo, hemoglobina e melanina) na região do visível6,7.然而 ， 大多数 的 ， ， 如 氢 卟酚 、 卟啉 和 ， ， 相对 较 短 短 的 吸收 （频率 <680 nm） ， 因此 对 生物 分子 （（如 蛋白 和 黑色素） ， 因此 对 生物 生物 （（如 血红 蛋白 黑色素））） 的 对 生物 生物 生物 生物 生物 生物 生物 生物 生物 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收导致光穿透性差。然而 ， 大多数 的 ， ， 二 卟酚 、 卟啉 ， ， 相对 较 短 短 的 吸收 （频率 频率 <680 nm） 因此 由于 对 分子 （血红 蛋白 和 黑色素 的 的 的 ， 因此 由于 分子 （血红 蛋白 黑色素） 的 的 ， ， ， ， ， 吸收 吸收 吸收 ， ， ， ， ， 血红 血红 蛋白 的 的 的 的 ， ， 血红 血红 血红 蛋白 和 的 的 的 的吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. No entanto, a maioria dos fotossensibilizadores tradicionais, como clorinas, porfirinas e antraquinonas, têm absorção de comprimento de onda relativamente curto (frequência < 680 nm) devido à forte absorção de biomoléculas como hemoglobina e melanina, resultando em baixa penetração de luz.Área visível 6.7.Portanto, fotossensibilizadores de absorção de infravermelho próximo (NIR) que são ativados na “janela terapêutica” de 700-900 nm são adequados para fototerapia.Como a luz do infravermelho próximo é a menos absorvida pelos tecidos biológicos, pode levar a uma penetração mais profunda e menos fotodano8,9.
Infelizmente, os fotossensibilizadores de absorção de NIR existentes geralmente têm baixa fotoestabilidade, baixa capacidade de geração de oxigênio singlete (1O2) e supressão de 1O2 induzida por agregação, o que limita sua aplicação clínica10,11.Embora grandes esforços tenham sido feitos para melhorar as propriedades fotofísicas e fotoquímicas de fotossensibilizadores convencionais, até agora vários relatos relataram que fotossensibilizadores que absorvem NIR podem resolver todos esses problemas.Além disso, vários fotossensibilizadores mostraram-se promissores para a geração eficiente de 1O212,13,14 quando irradiados com luz acima de 800 nm, uma vez que a energia do fóton diminui rapidamente na região do IR próximo.Trifenilamina (TFA) como um doador de elétrons e [1,2,5]tiadiazol-[3,4-i]dipirido[a,c]fenazina (TDP) como um grupo aceptor de elétrons Corantes do tipo doador-aceptor (DA) uma classe de corantes , absorvendo o infravermelho próximo, que foram extensivamente estudados para bioimagem do infravermelho próximo II e terapia fototérmica (PTT) devido ao seu estreito bandgap.Assim, os corantes do tipo DA podem ser usados ​​para PDT com excitação próxima ao IR, embora raramente tenham sido estudados como fotossensibilizadores para PDT.
É bem conhecido que a alta eficiência de cruzamento intersistema (ISC) de fotossensibilizadores promove a formação de 1O2.Uma estratégia comum para o avanço do processo ISC é melhorar o acoplamento spin-órbita (SOC) de fotossensibilizadores, introduzindo átomos pesados ​​ou porções orgânicas especiais.No entanto, essa abordagem ainda apresenta algumas desvantagens e limitações19,20.Recentemente, a automontagem supramolecular forneceu uma abordagem inteligente de baixo para cima para a fabricação de materiais funcionais em nível molecular,21,22 com inúmeras vantagens em fototerapia: (1) fotossensibilizadores automontados podem ter o potencial de formar estruturas de fita.Semelhante a estruturas eletrônicas com uma distribuição mais densa de níveis de energia devido à sobreposição de órbitas entre os blocos de construção.Portanto, o casamento de energia entre o estado excitado singleto inferior (S1) e o estado excitado tripleto vizinho (Tn) será melhorado, o que é benéfico para o processo ISC 23, 24 .(2) A montagem supramolecular reduzirá o relaxamento não radiativo baseado no mecanismo de limitação de movimento intramolecular (RIM), que também promove o processo ISC 25, 26 .(3) O conjunto supramolecular pode proteger as moléculas internas do monômero da oxidação e degradação, melhorando assim a fotoestabilidade do fotossensibilizador.Dadas as vantagens acima, acreditamos que os sistemas fotossensibilizadores supramoleculares podem ser uma alternativa promissora para superar as deficiências da PDT.
Complexos à base de Ru(II) são uma plataforma médica promissora para aplicações potenciais no diagnóstico e terapia de doenças devido às suas propriedades biológicas únicas e atraentes28,29,30,31,32,33,34.Além disso, a abundância de estados excitados e as propriedades fotofisicoquímicas ajustáveis ​​de complexos à base de Ru(II) proporcionam grandes vantagens para o desenvolvimento de fotossensibilizadores à base de Ru(II)35,36,37,38,39,40.Um exemplo notável é o complexo de polipiridil de rutênio(II) TLD-1433, que está atualmente em ensaios clínicos de Fase II como um fotossensibilizador para o tratamento de câncer de bexiga não músculo invasivo (NMIBC)41.Além disso, os complexos organometálicos de rutênio(II)areno são amplamente utilizados como agentes quimioterápicos para o tratamento do câncer devido à sua baixa toxicidade e facilidade de modificação42,43,44,45.As propriedades iônicas dos complexos organometálicos Ru(II)-areno podem não apenas melhorar a baixa solubilidade dos cromóforos DA em solventes comuns, mas também melhorar a montagem dos cromóforos DA.Além disso, a estrutura semi-sanduíche pseudooctaédrica dos complexos organometálicos de Ru(II)-arenos pode impedir estericamente a agregação H de cromóforos do tipo DA, facilitando assim a formação de agregação J com bandas de absorção desviadas para o vermelho.No entanto, as desvantagens inerentes dos complexos Ru(II)-areno, como baixa estabilidade e/ou baixa biodisponibilidade, podem afetar a eficácia terapêutica e a atividade in vivo dos complexos areno-Ru(II).No entanto, estudos mostraram que essas desvantagens podem ser superadas encapsulando complexos de rutênio com polímeros biocompatíveis por encapsulamento físico ou conjugação covalente.
Neste trabalho, relatamos complexos de Ru(II)-areno (RuDA) conjugados com DA com um gatilho NIR através de uma ligação de coordenação entre o cromóforo DAD e a porção Ru(II)-areno.Os complexos resultantes podem se auto-montar em vesículas metalosupramoleculares em água devido a interações não covalentes.Notavelmente, o conjunto supramolecular dotou RuDA com propriedades de cruzamento intersistema induzida por polimerização, o que aumentou significativamente a eficiência de ISC, o que foi muito favorável para PDT (Fig. 1A).Para aumentar o acúmulo de tumor e a biocompatibilidade in vivo, o Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) aprovado pela FDA foi usado para encapsular RuDA47,48,49 para criar nanopartículas de RuDA-NP (Figura 1B) que atuaram como um PDT/Dual-PDT altamente eficiente modo proxy PTT.Na fototerapia do câncer (Figura 1C), RuDA-NP foi usado para tratar camundongos nude com tumores MDA-MB-231 para estudar a eficácia da PDT e PTT in vivo.
Ilustração esquemática do mecanismo fotofísico de RuDA em formas monoméricas e agregadas para fototerapia de câncer, síntese de B RuDA-NPs e C RuDA-NPs para PDT e PTT ativados por NIR.
RuDA, consistindo em funcionalidade TPA e TDP, foi preparado de acordo com o procedimento mostrado na Figura Suplementar 1 (Figura 2A), e RuDA foi caracterizado por espectros de RMN de 1H e 13C, espectrometria de massa de ionização por eletropulverização e análise elementar (Figuras Complementares 2-4 ).O mapa de diferença de densidade eletrônica RuDA da transição singleto mais baixa foi calculado pela teoria funcional de densidade dependente do tempo (TD-DFT) para estudar o processo de transferência de carga.Conforme mostrado na Figura Complementar 5, a densidade eletrônica deriva principalmente da trifenilamina para a unidade aceitadora de TDP após a fotoexcitação, o que pode ser atribuído a uma transição típica de transferência de carga intramolecular (CT).
Estrutura química do Minério. B Espectros de absorção do Minério em misturas de várias proporções de DMF e água.C Valores de absorção normalizados de RuDA (800 nm) e ICG (779 nm) versus tempo a 0,5 W cm-2 de luz laser de 808 nm.D A fotodegradação de ABDA é indicada pela formação de 1O2 induzida por RuDA em misturas de DMF/H2O com diferentes teores de água sob ação de radiação laser com comprimento de onda de 808 nm e potência de 0,5 W/cm2.
Resumo—A espectroscopia de absorção no UV-visível foi usada para estudar as propriedades de automontagem do minério em misturas de DMF e água em várias proporções.Como mostrado na fig.2B, RuDA exibe bandas de absorção de 600 a 900 nm em DMF com uma banda de absorção máxima em 729 nm.O aumento da quantidade de água levou a um desvio gradual para o vermelho da absorção máxima do minério para 800 nm, o que indica a agregação J do minério no sistema montado.Os espectros de fotoluminescência de RuDA em diferentes solventes são mostrados na Figura Suplementar 6. RuDA parece exibir luminescência NIR-II típica com um comprimento de onda máximo de emissão de ca.1050 nm em CH2Cl2 e CH3OH, respectivamente.O grande deslocamento de Stokes (cerca de 300 nm) de RuDA indica uma mudança significativa na geometria do estado excitado e a formação de estados excitados de baixa energia.Os rendimentos quânticos de luminescência de minério em CH2Cl2 e CH3OH foram determinados em 3,3 e 0,6%, respectivamente.No entanto, em uma mistura de metanol e água (5/95, v/v), foi observado um leve redshift da emissão e uma diminuição no rendimento quântico (0,22%), o que pode ser devido à automontagem do minério .
Para visualizar a auto-montagem de ORE, usamos microscopia de força atômica líquida (AFM) para visualizar as alterações morfológicas em ORE em solução de metanol após a adição de água.Quando o teor de água estava abaixo de 80%, nenhuma agregação clara foi observada (Fig. 7 complementar).No entanto, com um aumento adicional no teor de água para 90-95%, apareceram pequenas nanopartículas, que indicaram a automontagem do minério. Além disso, a irradiação a laser com comprimento de onda de 808 nm não afetou a intensidade de absorção de RuDA em solução (Fig. 2C e Fig. 8 Suplementar).Em contraste, a absorbância do verde de indocianina (ICG como controle) caiu rapidamente em 779 nm, indicando excelente fotoestabilidade do RuDA.Além disso, a estabilidade de RuDA-NPs em PBS (pH = 5,4, 7,4 e 9,0), 10% FBS e DMEM (glicose alta) foi examinada por espectroscopia de absorção UV-visível em vários pontos de tempo.Conforme mostrado na Figura Suplementar 9, pequenas alterações nas bandas de absorção de RuDA-NP foram observadas em PBS em pH 7,4/9,0, FBS e DMEM, indicando excelente estabilidade de RuDA-NP.No entanto, em meio ácido (рН = 5,4) foi encontrada hidrólise do minério.Também avaliamos ainda a estabilidade de RuDA e RuDA-NP usando métodos de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).Conforme mostrado na Figura Suplementar 10, RuDA foi estável em uma mistura de metanol e água (50/50, v/v) durante a primeira hora, e a hidrólise foi observada após 4 horas.No entanto, apenas um amplo pico côncavo-convexo foi observado para NPs RuDA.Portanto, a cromatografia de permeação em gel (GPC) foi usada para avaliar a estabilidade de RuDA NPs em PBS (pH = 7,4).Conforme mostrado na Figura Complementar 11, após 8 horas de incubação nas condições testadas, a altura do pico, a largura do pico e a área do pico do NP RuDA não mudaram significativamente, indicando excelente estabilidade do NP RuDA.Além disso, as imagens TEM mostraram que a morfologia das nanopartículas RuDA-NP permaneceu praticamente inalterada após 24 horas em tampão PBS diluído (pH = 7,4, Fig. 12 suplementar).
Como a automontagem pode conferir diferentes características funcionais e químicas ao minério, observamos a liberação de ácido 9,10-antracenodiilbis(metileno)dimalônico (ABDA, indicador 1O2) em misturas metanol-água.Minério com conteúdo de água diferente50.Conforme mostrado na Figura 2D e na Figura Suplementar 13, nenhuma degradação de ABDA foi observada quando o teor de água estava abaixo de 20%.Com o aumento da umidade para 40%, ocorreu a degradação do ABDA, evidenciada pela diminuição da intensidade da fluorescência do ABDA.Também foi observado que maior teor de água resulta em degradação mais rápida, sugerindo que a auto-montagem de RuDA é necessária e benéfica para a degradação de ABDA.Este fenômeno é muito diferente dos modernos cromóforos ACQ (extinção induzida por agregação).Quando irradiado com um laser com comprimento de onda de 808 nm, o rendimento quântico de 1O2 RuDA em uma mistura de 98% H2O/2% DMF é de 16,4%, que é 82 vezes maior que o de ICG (ΦΔ = 0,2%)51, demonstrando uma notável eficiência de geração de 1O2 RuDA no estado de agregação.
Spins de elétrons usando 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinona (TEMP) e 5,5-dimetil-1-pirrolina N-óxido (DMPO) como spin traps A espectroscopia de ressonância (ESR) foi usada para identificar as espécies resultantes AFK.por RuDA.Conforme mostrado na Figura Suplementar 14, foi confirmado que 1O2 é gerado em tempos de irradiação entre 0 e 4 minutos.Além disso, quando RuDA foi incubado com DMPO sob irradiação, foi detectado um sinal EPR típico de quatro linhas de aduto DMPO-OH· 1:2:2:1, indicando a formação de radicais hidroxila (OH·).No geral, os resultados acima demonstram a capacidade do RuDA de estimular a produção de ROS através de um processo de fotossensibilização tipo I/II duplo.
Para entender melhor as propriedades eletrônicas do RuDA nas formas monoméricas e agregadas, os orbitais moleculares de fronteira do RuDA nas formas monoméricas e diméricas foram calculados usando o método DFT.Como mostrado na fig.3A, o orbital molecular ocupado mais alto (HOMO) do RuDA monomérico é deslocalizado ao longo da estrutura do ligante e o orbital molecular desocupado mais baixo (LUMO) está centrado na unidade aceitadora de TDP.Pelo contrário, a densidade eletrônica no HOMO dimérico está concentrada no ligante de uma molécula de RuDA, enquanto a densidade eletrônica no LUMO está concentrada principalmente na unidade aceitadora de outra molécula de RuDA, o que indica que RuDA está no dímero.Características do TC.
A O HOMO e o LUMO do Minério são calculados nas formas monomérica e dimérica.B Níveis de energia singleto e tripleto de minério em monômeros e dímeros.C Níveis estimados de RuDA e possíveis canais ISC como C monomérico e D dimérico. As setas indicam possíveis canais ISC.
A distribuição de elétrons e lacunas nos estados excitados singlete de baixa energia do RuDA nas formas monomérica e dimérica foi analisada usando o software Multiwfn 3.852.53, que foram calculados pelo método TD-DFT.Conforme indicado na etiqueta adicional.Como mostrado nas Figuras 1-2, os buracos RDA monoméricos são principalmente deslocalizados ao longo da estrutura do ligante nesses estados excitados singlete, enquanto os elétrons estão localizados principalmente no grupo TDP, demonstrando as características intramoleculares da CT.Além disso, para esses estados excitados singlete, há mais ou menos sobreposição entre buracos e elétrons, sugerindo que esses estados excitados singletos fazem alguma contribuição da excitação local (LE).Para os dímeros, além das características CT intramoleculares e LE, uma certa proporção de características CT intermoleculares foram observadas nos respectivos estados, especialmente S3, S4, S7 e S8, com base na análise CT intermolecular, sendo as transições intermoleculares CT as principais (Tabela Complementar).3).
Para entender melhor os resultados experimentais, exploramos ainda mais as propriedades dos estados excitados de RuDA para explorar as diferenças entre monômeros e dímeros (Tabelas Suplementares 4-5).Conforme mostrado na Figura 3B, os níveis de energia dos estados excitados singleto e tripleto do dímero são muito mais densos do que os do monômero, o que ajuda a reduzir a diferença de energia entre S1 e Tn. Foi relatado que as transições ISC podem ser realizadas dentro de um pequeno intervalo de energia (ΔES1-Tn < 0,3 eV) entre S1 e Tn54. Foi relatado que as transições ISC podem ser realizadas dentro de um pequeno intervalo de energia (ΔES1-Tn < 0,3 eV) entre S1 e Tn54. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энергетической щели (ΔES1-Tn <0,3 эВ) между S1 и Tn54. Foi relatado que as transições ISC podem ser realizadas dentro de um pequeno intervalo de energia (ΔES1-Tn <0,3 eV) entre S1 e Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 Сообщалось, что переход ISC может быть реализован в пределах небольшой энергетической щели (ΔES1-Tn < 0,3 эВ) между S1 и Tn54. Foi relatado que a transição ISC pode ser realizada dentro de um pequeno intervalo de energia (ΔES1-Tn < 0,3 eV) entre S1 e Tn54.Além disso, apenas um orbital, ocupado ou desocupado, deve diferir em estados singleto e tripleto ligados para fornecer uma integral SOC diferente de zero.Assim, com base na análise da energia de excitação e da transição orbital, todos os canais possíveis da transição ISC são mostrados nas Figs.3C, D.Notavelmente, apenas um canal ISC está disponível no monômero, enquanto a forma dimérica possui quatro canais ISC que podem melhorar a transição ISC.Portanto, é razoável supor que quanto mais moléculas de RuDA forem agregadas, mais acessíveis serão os canais ISC.Portanto, os agregados RuDA podem formar estruturas eletrônicas de duas bandas nos estados singleto e tripleto, reduzindo o gap de energia entre S1 e Tn disponível, aumentando assim a eficiência do ISC para facilitar a geração de 1O2.
Para elucidar ainda mais o mecanismo subjacente, sintetizamos um composto de referência do complexo areno-Ru(II) (RuET) substituindo dois grupos etil por dois grupos trifenilamina fenil em RuDA (Fig. 4A, para caracterização completa, consulte ESI, Suplementar 15 -21 ) Do doador (dietilamina) ao aceitador (TDF), o RuET tem as mesmas características de CT intramolecular que o RuDA.Como esperado, o espectro de absorção de RuET em DMF mostrou uma banda de transferência de carga de baixa energia com forte absorção na região do infravermelho próximo na região de 600-1100 nm (Fig. 4B).Além disso, a agregação de RuET também foi observada com o aumento do teor de água, o que se refletiu no desvio para o vermelho do máximo de absorção, o que foi confirmado pela imagem AFM líquida (Fig. 22 suplementar).Os resultados mostram que RuET, como RuDA, pode formar estados intramoleculares e auto-montar em estruturas agregadas.
Estrutura química do RuET.B Espectros de absorção de RuET em misturas de várias proporções de DMF e água.Parcelas C EIS Nyquist para RuDA e RuET.Respostas de fotocorrente D de RuDA e RuET sob a ação de radiação laser com comprimento de onda de 808 nm.
A fotodegradação do ABDA na presença de RuET foi avaliada por irradiação com laser com comprimento de onda de 808 nm.Surpreendentemente, nenhuma degradação de ABDA foi observada em várias frações de água (Fig. 23 suplementar).Uma possível razão é que RuET não pode formar eficientemente uma estrutura eletrônica em bandas porque a cadeia etila não promove uma transferência de carga intermolecular eficiente.Portanto, espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e medidas de fotocorrente transiente foram realizadas para comparar as propriedades fotoeletroquímicas de RuDA e RuET.De acordo com o gráfico de Nyquist (Figura 4C), RuDA mostra um raio muito menor que RuET, o que significa que RuDA56 tem transporte de elétrons intermolecular mais rápido e melhor condutividade.Além disso, a densidade de fotocorrente do RuDA é muito maior que a do RuET (Fig. 4D), confirmando a melhor eficiência de transferência de carga do RuDA57.Assim, o grupo fenil da trifenilamina no minério desempenha um papel importante na transferência de carga intermolecular e na formação de uma estrutura eletrônica em bandas.
Para aumentar o acúmulo de tumor e a biocompatibilidade in vivo, encapsulamos ainda RuDA com F127.O diâmetro hidrodinâmico médio de RuDA-NPs foi determinado em 123,1 nm com uma distribuição estreita (PDI = 0,089) usando o método de dispersão dinâmica de luz (DLS) (Figura 5A), que promoveu o acúmulo de tumor aumentando a permeabilidade e a retenção.efeito EPR).As imagens TEM mostraram que as NPs de minério têm uma forma esférica uniforme com um diâmetro médio de 86 nm.Notavelmente, o máximo de absorção de RuDA-NPs apareceu em 800 nm (Fig. 24 suplementar), indicando que RuDA-NPs pode reter as funções e propriedades de RuDAs de auto-montagem.O rendimento quântico de ROS calculado para NP Ore é de 15,9%, o que é comparável ao Ore. As propriedades fototérmicas de NPs RuDA foram estudadas sob a ação de radiação laser com comprimento de onda de 808 nm usando uma câmera infravermelha.Como mostrado na fig.5B,C, o grupo controle (somente PBS) experimentou um ligeiro aumento na temperatura, enquanto a temperatura da solução de RuDA-NPs aumentou rapidamente com o aumento da temperatura (ΔT) para 15,5, 26,1 e 43,0°C.As altas concentrações foram 25, 50 e 100 µM, respectivamente, o que indica um forte efeito fototérmico das NPs RuDA.Além disso, medições do ciclo de aquecimento/resfriamento foram feitas para avaliar a estabilidade fototérmica do RuDA-NP e comparar com o ICG.A temperatura das NPs de minério não diminuiu após cinco ciclos de aquecimento/resfriamento (Fig. 5D), o que indica a excelente estabilidade fototérmica das NPs de minério.Em contraste, o ICG exibe menor estabilidade fototérmica como visto pelo aparente desaparecimento do platô de temperatura fototérmica sob as mesmas condições.De acordo com o método anterior58, a eficiência de conversão fototérmica (PCE) do RuDA-NP foi calculada em 24,2%, o que é superior aos materiais fototérmicos existentes, como nanobastões de ouro (21,0%) e nanoconchas de ouro (13,0%)59.Assim, o NP Ore apresenta excelentes propriedades fototérmicas, o que os torna agentes PTT promissores.
Análise de imagens DLS e TEM de NPs RuDA (inserção).B Imagens térmicas de várias concentrações de NPs RuDA expostas à radiação laser em um comprimento de onda de 808 nm (0,5 W cm-2).C Curvas de conversão fototérmica de várias concentrações de NPs de minério, que são dados quantitativos.B. D Aumento da temperatura de ORE NP e ICG em 5 ciclos de aquecimento-resfriamento.
A fotocitotoxicidade de NPs RuDA contra células de câncer de mama humano MDA-MB-231 foi avaliada in vitro.Como mostrado na fig.6A, B, RuDA-NPs e RuDA exibiram citotoxicidade insignificante na ausência de irradiação, implicando menor toxicidade escura de RuDA-NPs e RuDA.No entanto, após a exposição à radiação laser em um comprimento de onda de 808 nm, os NPs RuDA e RuDA mostraram forte fotocitotoxicidade contra células cancerígenas MDA-MB-231 com valores de IC50 (concentração inibitória semi-máxima) de 5,4 e 9,4 μM, respectivamente, demonstrando que RuDA-NP e RuDA têm potencial para fototerapia de câncer.Além disso, a fotocitotoxicidade de RuDA-NP e RuDA foi investigada na presença de vitamina C (Vc), um eliminador de ROS, para elucidar o papel das ROS na citotoxicidade induzida pela luz.Obviamente, a viabilidade celular aumentou após a adição de Vc, e os valores de IC50 de RuDA e RuDA NPs foram 25,7 e 40,0 μM, respectivamente, o que comprova o importante papel das ROS na fotocitotoxicidade de RuDA e RuDA NPs.Citotoxicidade induzida por luz de RuDA-NPs e RuDA em células cancerosas MDA-MB-231 por coloração de células vivas/mortas usando calceína AM (fluorescência verde para células vivas) e iodeto de propídio (PI, fluorescência vermelha para células mortas).confirmado por células) como sondas fluorescentes.Conforme mostrado na Figura 6C, as células tratadas com RuDA-NP ou RuDA permaneceram viáveis ​​sem irradiação, como evidenciado pela intensa fluorescência verde.Ao contrário, sob irradiação a laser, apenas fluorescência vermelha foi observada, o que confirma a fotocitotoxicidade efetiva de RuDA ou NPs RuDA.Vale ressaltar que a fluorescência verde apareceu após a adição de Vc, o que indica uma violação da fotocitotoxicidade de RuDA e RuDA NPs.Estes resultados são consistentes com os ensaios de fotocitotoxicidade in vitro.
Viabilidade dose-dependente de células A RuDA- e B RuDA-NP em células MDA-MB-231 na presença ou ausência de Vc (0,5 mM), respectivamente.Barras de erro, média ± desvio padrão (n = 3). Testes t bilaterais não pareados *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Testes t bilaterais não pareados *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Testes t bicaudais não pareados *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Testes t bicaudais não pareados *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.C Análise de coloração de células vivas/mortas usando calceína AM e iodeto de propídio como sondas fluorescentes.Barra de escala: 30 µm.Imagens representativas de três repetições biológicas de cada grupo são mostradas.D Imagens de fluorescência confocal da produção de ROS em células MDA-MB-231 sob diferentes condições de tratamento.A fluorescência verde DCF indica a presença de ROS.Irradiar com laser de comprimento de onda de 808 nm com potência de 0,5 W/cm2 por 10 minutos (300 J/cm2).Barra de escala: 30 µm.Imagens representativas de três repetições biológicas de cada grupo são mostradas.E Análise de tratamento de RuDA-NPs (50 µM) ou RuDA (50 µM) por citometria de fluxo com ou sem laser de 808 nm (0,5 W cm-2) na presença e ausência de Vc (0,5 mM) por 10 min.Imagens representativas de três repetições biológicas de cada grupo são mostradas.F Nrf-2, HSP70 e HO-1 de células MDA-MB-231 tratadas com RuDA-NPs (50 µM) com ou sem irradiação a laser de 808 nm (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), células expressam 2).Imagens representativas de duas repetições biológicas de cada grupo são mostradas.
A produção intracelular de ROS em células MDA-MB-231 foi examinada usando o método de coloração de diacetato de 2,7-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA).Como mostrado na fig.6D, as células tratadas com RuDA-NPs ou RuDA exibiram fluorescência verde distinta quando irradiadas com o laser de 808 nm, indicando que RuDA-NPs e RuDA têm uma capacidade eficiente de gerar ROS.Ao contrário, na ausência de luz ou na presença de Vc, observou-se apenas um fraco sinal fluorescente das células, o que indicou uma leve formação de ROS.Os níveis intracelulares de ROS em células RuDA-NP e células MDA-MB-231 tratadas com RuDA foram ainda determinados por citometria de fluxo.Conforme mostrado na Figura Complementar 25, a intensidade de fluorescência média (MFI) gerada por RuDA-NPs e RuDA sob irradiação de laser de 808 nm foi significativamente aumentada em cerca de 5,1 e 4,8 vezes, respectivamente, em comparação com o grupo controle, confirmando sua excelente formação AFK.capacidade.No entanto, os níveis intracelulares de ROS em células RuDA-NP ou MDA-MB-231 tratadas com RuDA foram apenas comparáveis ​​aos controles sem irradiação a laser ou na presença de Vc, semelhantes aos resultados da análise de fluorescência confocal.
Tem sido demonstrado que as mitocôndrias são o principal alvo dos complexos Ru(II)-areno60.Portanto, a localização subcelular de RuDA e RuDA-NPs foi investigada.Conforme mostrado na Figura Complementar 26, RuDA e RuDA-NP mostram perfis de distribuição celular semelhantes com o maior acúmulo nas mitocôndrias (62,5 ± 4,3 e 60,4 ± 3,6 ng/mg de proteína, respectivamente).No entanto, apenas uma pequena quantidade de Ru foi encontrada nas frações nucleares de Ore e NP Ore (3,5 e 2,1%, respectivamente).A fração celular restante continha rutênio residual: 31,7% (30,6 ± 3,4 ng/mg de proteína) para RuDA e 42,9% (47,2 ± 4,5 ng/mg de proteína) para RuDA-NPs.Em geral, Ore e NP Ore são principalmente acumulados nas mitocôndrias.Para avaliar a disfunção mitocondrial, usamos JC-1 e coloração MitoSOX Red para avaliar o potencial de membrana mitocondrial e a capacidade de produção de superóxido, respectivamente.Conforme mostrado na Fig. 27 Complementar, a fluorescência verde intensa (JC-1) e vermelha (MitoSOX Red) foi observada em células tratadas com RuDA e RuDA-NPs sob irradiação a laser de 808 nm, indicando que RuDA e RuDA-NPs são altamente fluorescentes Pode efetivamente induzir a despolarização da membrana mitocondrial e a produção de superóxido.Além disso, o mecanismo de morte celular foi determinado usando análise baseada em citometria de fluxo de anexina V-FITC/iodeto de propídio (PI).Conforme mostrado na Figura 6E, quando irradiado com laser de 808 nm, RuDA e RuDA-NP induziram uma taxa de apoptose precoce significativamente aumentada (quadrante inferior direito) em células MDA-MB-231 em comparação com PBS ou PBS mais laser.células processadas.No entanto, quando Vc foi adicionado, a taxa de apoptose de RuDA e RuDA-NP diminuiu significativamente de 50,9% e 52,0% para 15,8% e 17,8%, respectivamente, o que confirma o importante papel das ROS na fotocitotoxicidade de RuDA e RuDA-NP..Além disso, discretas células necróticas foram observadas em todos os grupos testados (quadrante superior esquerdo), sugerindo que a apoptose pode ser a forma predominante de morte celular induzida por RuDA e RuDA-NPs.
Como o dano do estresse oxidativo é um dos principais determinantes da apoptose, o fator nuclear associado ao eritróide 2, fator 2 (Nrf2) 62, um regulador chave do sistema antioxidante, foi investigado em MDA-MB-231 tratado com RuDA-NPs.Mecanismo de ação das NPs RuDA induzidas por irradiação.Ao mesmo tempo, a expressão da proteína heme oxigenase 1 (HO-1) a jusante também foi detectada.Conforme mostrado na Figura 6F e na Figura Suplementar 29, a fototerapia mediada por RuDA-NP aumentou os níveis de expressão de Nrf2 e HO-1 em comparação com o grupo PBS, indicando que RuDA-NPs pode estimular vias de sinalização de estresse oxidativo.Além disso, para estudar o efeito fototérmico de RuDA-NPs63, a expressão da proteína de choque térmico Hsp70 também foi avaliada.Fica claro que células tratadas com RuDA-NPs + irradiação com laser de 808 nm apresentaram expressão aumentada de Hsp70 em relação aos outros dois grupos, refletindo uma resposta celular à hipertermia.
Os notáveis ​​resultados in vitro nos levaram a investigar o desempenho in vivo de RuDA-NP em camundongos nude com tumores MDA-MB-231.A distribuição tecidual de NPs RuDA foi estudada determinando o conteúdo de rutênio no fígado, coração, baço, rins, pulmões e tumores.Como mostrado na fig.7A, o teor máximo de NPs de Ore em órgãos normais apareceu no primeiro tempo de observação (4 h), enquanto o teor máximo foi determinado em tecidos tumorais 8 horas após a injeção, possivelmente devido a NPs de Ore.Efeito EPR de LF.De acordo com os resultados de distribuição, a duração ideal do tratamento com minério de NP foi tomada 8 horas após a administração.Para ilustrar o processo de acumulação de RuDA-NPs em locais de tumor, as propriedades fotoacústicas (PA) de RuDA-NPs foram monitoradas gravando os sinais PA de RuDA-NPs em diferentes momentos após a injeção.Primeiro, o sinal PA de RuDA-NP in vivo foi avaliado pela gravação de imagens PA de um local de tumor após injeção intratumoral de RuDA-NP.Conforme mostrado na Figura Complementar 30, RuDA-NPs mostraram um forte sinal de PA e houve uma correlação positiva entre a concentração de RuDA-NP e a intensidade do sinal de PA (Figura Complementar 30A).Em seguida, imagens de PA in vivo dos locais do tumor foram registradas após a injeção intravenosa de RuDA e RuDA-NP em diferentes pontos de tempo após a injeção.Conforme mostrado na Figura 7B, o sinal PA de RuDA-NPs do local do tumor aumentou gradualmente com o tempo e atingiu um platô em 8 horas após a injeção, consistente com os resultados de distribuição tecidual determinados pela análise de ICP-MS.Com relação ao RuDA (Fig. 30B suplementar), a intensidade máxima do sinal PA apareceu 4 horas após a injeção, indicando uma rápida taxa de entrada de RuDA no tumor.Além disso, o comportamento excretor de RuDA e RuDA-NPs foi investigado determinando a quantidade de rutênio na urina e nas fezes usando ICP-MS.A principal via de eliminação de RuDA (Fig. 31 suplementar) e RuDA-NPs (Fig. 7C) é através das fezes, e a depuração efetiva de RuDA e RuDA-NPs foi observada durante o período de estudo de 8 dias, o que significa que RuDA e RuDA-NPs podem ser eliminados eficientemente do corpo sem toxicidade a longo prazo.
A. A distribuição ex vivo de RuDA-NP em tecidos de camundongos foi determinada pelo teor de Ru (porcentagem da dose administrada de Ru (ID) por grama de tecido) em diferentes momentos após a injeção.Os dados são média ± desvio padrão (n = 3). Testes t bilaterais não pareados *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Testes t bilaterais não pareados *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Testes t bicaudais não pareados *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Testes t bicaudais não pareados *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.B PA imagens de sítios tumorais in vivo em excitação de 808 nm após administração intravenosa de RuDA-NPs (10 µmol kg-1) em diferentes pontos de tempo.Após administração intravenosa de RuDA NPs (10 µmol kg-1), C Ru foi excretado de camundongos com urina e fezes em diferentes intervalos de tempo.Os dados são média ± desvio padrão (n = 3).
A capacidade de aquecimento de RuDA-NP in vivo foi estudada em camundongos nude com tumores MDA-MB-231 e RuDA para comparação.Como mostrado na fig.8A e Fig. 32 suplementar, o grupo controle (solução salina) apresentou menor mudança de temperatura (ΔT ≈ 3°C) após 10 minutos de exposição contínua.No entanto, a temperatura de RuDA-NPs e RuDA aumentou rapidamente com temperaturas máximas de 55,2 e 49,9 ° C, respectivamente, proporcionando hipertermia suficiente para terapia de câncer in vivo.O aumento observado na alta temperatura para NPs RuDA (ΔT ≈ 24°C) em comparação com RuDA (ΔT ≈ 19°C) pode ser devido à sua melhor permeabilidade e acúmulo nos tecidos tumorais devido ao efeito EPR.
Imagens térmicas infravermelhas de camundongos com tumores MDA-MB-231 irradiados com laser de 808 nm em diferentes tempos 8 horas após a injeção.Imagens representativas de quatro repetições biológicas de cada grupo são mostradas.B Volume tumoral relativo e C Massa tumoral média de diferentes grupos de camundongos durante o tratamento.D Curvas de peso corporal de diferentes grupos de camundongos.Irradiar com laser de comprimento de onda de 808 nm com potência de 0,5 W/cm2 por 10 minutos (300 J/cm2).Barras de erro, média ± desvio padrão (n = 3). Testes t bilaterais não pareados *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Testes t bilaterais não pareados *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Testes t bicaudais não pareados *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Testes t bicaudais não pareados *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. E Imagens de coloração H&E dos principais órgãos e tumores de diferentes grupos de tratamento, incluindo os grupos Saline, Saline + Laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs e RuDA-NPs + Laser. E Imagens de coloração H&E dos principais órgãos e tumores de diferentes grupos de tratamento, incluindo os grupos Saline, Saline + Laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs e RuDA-NPs + Laser. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. E Imagens de coloração H&E dos principais órgãos e tumores de diferentes grupos de tratamento, incluindo os grupos solução salina, solução salina + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs e RuDA-NPs + Laser.来自 不同 治疗 的 主要 器官 和 肿瘤 的 e h & e 染色 ， ， 盐水 、 、 水 + 激光 、 ruda 、 ruda + 激光 ruda-nps 和 ruda-nps + 激光组。来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. E Coloração H&E dos principais órgãos e tumores de vários grupos de tratamento, incluindo solução salina, solução salina + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs e RuDA-NPs + laser.Barra de escala: 60 µm.
O efeito da fototerapia in vivo com RuDA e RuDA NPs foi avaliado em que camundongos nus com tumores MDA-MB-231 foram injetados intravenosamente com RuDA ou RuDA NPs em uma dose única de 10,0 µmol kg-1 através da veia da cauda e, em seguida, 8 horas após a injeção.irradiação a laser com comprimento de onda de 808 nm.Conforme mostrado na Figura 8B, os volumes tumorais aumentaram significativamente nos grupos de solução salina e laser, indicando que a irradiação com solução salina ou laser 808 teve pouco efeito no crescimento do tumor.Assim como no grupo da solução salina, o rápido crescimento tumoral também foi observado em camundongos tratados com RuDA-NPs ou RuDA na ausência de irradiação com laser, demonstrando sua baixa toxicidade no escuro.Em contraste, após a irradiação a laser, tanto o tratamento com RuDA-NP quanto com RuDA induziram regressão significativa do tumor com reduções de volume tumoral de 95,2% e 84,3%, respectivamente, em comparação com o grupo tratado com solução salina, indicando excelente PDT sinérgica., mediado pelo efeito RuDA/CHTV.– NP ou Ore. Comparado com RuDA, NPs RuDA mostraram um melhor efeito fototerapêutico, que se deveu principalmente ao efeito EPR de NPs RuDA.Os resultados da inibição do crescimento do tumor foram ainda avaliados pelo peso do tumor excisado no dia 15 de tratamento (Fig. 8C e Fig. 33 Suplementar).A massa tumoral média em camundongos tratados com RuDA-NP e camundongos tratados com RuDA foi de 0,08 e 0,27 g, respectivamente, que foi muito mais leve do que no grupo controle (1,43 g).
Além disso, o peso corporal dos camundongos foi registrado a cada três dias para estudar a toxicidade escura de RuDA-NPs ou RuDA in vivo.Conforme mostrado na Figura 8D, não foram observadas diferenças significativas no peso corporal para todos os grupos de tratamento. Além disso, foi realizada a coloração de hematoxilina e eosina (H&E) dos principais órgãos (coração, fígado, baço, pulmão e rim) de diferentes grupos de tratamento. Além disso, foi realizada a coloração de hematoxilina e eosina (H&E) dos principais órgãos (coração, fígado, baço, pulmão e rim) de diferentes grupos de tratamento. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) из разных групп лечения. Além disso, foi realizada coloração de hematoxilina e eosina (H&E) dos principais órgãos (coração, fígado, baço, pulmões e rins) de diferentes grupos de tratamento.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行苏木精和伊红(H&E) 染色　 (ELE) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) в различных группах лечения. Além disso, a coloração de hematoxilina e eosina (H&E) dos principais órgãos (coração, fígado, baço, pulmão e rim) foi realizada em diferentes grupos de tratamento.Como mostrado na Fig.8E, as imagens de coloração H&E de cinco órgãos principais dos grupos RuDA-NPs e RuDA não exibem anormalidades óbvias ou danos nos órgãos. 8E, as imagens de coloração H&E de cinco órgãos principais dos grupos RuDA-NPs e RuDA não exibem anormalidades óbvias ou danos nos órgãos.Como mostrado na fig.8e, ззз зз зз зз зз зз зз зз ззж з зз зш зш зш зш зш зш зш зш зш з зз зш зш зш з зз зш зш зш зш з зз зш зшрт зш ззж зшр зшр зшт зшт зштттттfia. 8E, imagens de coloração H&E de cinco órgãos principais dos grupos RuDA-NPs e RuDA não mostram anormalidades ou lesões óbvias nos órgãos.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显示出明显的异常或器官损伤㸸或器官损如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Ка п п п land ко п п landк позазазанз ки ко п к к land ко з п land зо зо к к land зо зо ко land з з зо land з з зо land з з з land з з з land з з зо land зо зо land зо зо land зи з land з з зо land з з п land з з зо land з п п land з з п land з з 12e з з и з и и и и и и и и и и и й з. Conforme mostrado na Figura 8E, as imagens de coloração H&E dos cinco principais órgãos dos grupos RuDA-NPs e RuDA não mostraram anormalidades óbvias ou danos nos órgãos.Esses resultados mostraram que nem RuDA-NP nem RuDA mostraram sinais de toxicidade in vivo. Além disso, imagens de tumores de coloração H&E mostraram que ambos os grupos RuDA + Laser e RuDA-NPs + Laser podem causar destruição severa de células cancerígenas, demonstrando a excelente eficácia fototerapêutica in vivo de RuDA e RuDA-NPs. Além disso, imagens de tumores de coloração H&E mostraram que ambos os grupos RuDA + Laser e RuDA-NPs + Laser podem causar destruição severa de células cancerígenas, demonstrando a excelente eficácia fototerapêutica in vivo de RuDA e RuDA-NPs.Além disso, imagens tumorais coradas com hematoxilina-eosina mostraram que os grupos RuDA+Laser e RuDA-NPs+Laser podem induzir destruição severa de células cancerígenas, demonstrando a eficácia fototerapêutica superior de RuDA e RuDA-NPs in vivo.此外 ， 肿瘤 的 H & e 染色 图像 ， ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 可 导致 严重 的 癌细胞 ， ， 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 的 体内 功效。。 了 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 的 体内 功效。此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 显示 ， ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 导致 的 癌 细胞 ， ， 证明 ruda 和 ruda-nps 的 体内 光疗 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。Além disso, imagens tumorais coradas com hematoxilina e eosina mostraram que os grupos RuDA+Laser e RuDA-NPs+Laser resultaram em destruição severa de células cancerígenas, demonstrando eficácia fototerapêutica superior de RuDA e RuDA-NPs in vivo.
Em conclusão, o complexo organometálico Ru(II)-areno (RuDA) com ligantes do tipo DA foi projetado para facilitar o processo de ISC usando o método de agregação.O RuDA sintetizado pode se auto-montar por meio de interações não covalentes para formar sistemas supramoleculares derivados de RuDA, facilitando assim a formação de 1O2 e a conversão fototérmica eficiente para terapia de câncer induzida por luz.Vale ressaltar que o RuDA monomérico não gerou 1O2 sob irradiação de laser a 808 nm, mas conseguiu gerar uma grande quantidade de 1O2 no estado agregado, demonstrando a racionalidade e eficiência do nosso projeto.Estudos subsequentes mostraram que a montagem supramolecular confere ao RuDA propriedades fotofísicas e fotoquímicas aprimoradas, como absorção de redshift e resistência ao fotobranqueamento, que são altamente desejáveis ​​para o processamento de PDT e PTT.Experimentos in vitro e in vivo mostraram que NPs RuDA com boa biocompatibilidade e boa acumulação no tumor exibem excelente atividade anticancerígena induzida por luz após irradiação a laser em um comprimento de onda de 808 nm.Assim, NPs RuDA como reagentes PDT/PTW supramoleculares bimodais eficazes enriquecerão o conjunto de fotossensibilizadores ativados em comprimentos de onda acima de 800 nm.O projeto conceitual do sistema supramolecular fornece uma rota eficiente para fotossensibilizadores ativados por NIR com excelentes efeitos fotossensibilizantes.
Todos os produtos químicos e solventes foram obtidos de fornecedores comerciais e utilizados sem purificação adicional.O RuCl3 foi adquirido da Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, China).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolina-5,6-diona) e 4,7-bis[4-(N,N-difenilamino)fenil]-5 O ,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol foi sintetizado de acordo com estudos prévios64,65.Os espectros de RMN foram registrados em um espectrômetro Bruker Avance III-HD 600 MHz no Southeastern University Analytical Test Center usando d6-DMSO ou CDCl3 como solvente.Os deslocamentos químicos δ são dados em ppm.em relação ao tetrametilsilano, e as constantes de interação J são dadas em valores absolutos em hertz.A espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) foi realizada em um instrumento Agilent 6224 ESI/TOF MS.A análise elementar de C, H e N foi realizada em um analisador elementar Vario MICROCHNOS (Elementar).Os espectros de UV-visível foram medidos em um espectrofotômetro Shimadzu UV3600.Os espectros de fluorescência foram registrados em um espectrofluorímetro Shimadzu RF-6000.Os espectros de EPR foram registrados em um instrumento Bruker EMXmicro-6/1.A morfologia e estrutura das amostras preparadas foram estudadas em instrumentos FEI Tecnai G20 (TEM) e Bruker Icon (AFM) operando em tensão de 200 kV.A dispersão dinâmica de luz (DLS) foi realizada em um analisador Nanobrook Omni (Brookhaven).As propriedades fotoeletroquímicas foram medidas em uma configuração eletroquímica (CHI-660, China).As imagens fotoacústicas foram obtidas usando o sistema FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR.As imagens confocais foram obtidas usando um microscópio confocal Olympus FV3000.A análise FACS foi realizada em um citômetro de fluxo BD Calibur.Experimentos de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foram realizados em um sistema Waters Alliance e2695 usando um detector 2489 UV/Vis.Os testes de cromatografia de permeação em gel (GPC) foram registrados em um instrumento Thermo ULTIMATE 3000 usando um detector de índice de refração ERC RefratoMax520.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolina-5,6-diona)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4-(N, N-difenilamino)fenil]-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) e ácido acético glacial (30 mL) foram agitados em refrigerador de refluxo durante 12 horas.O solvente foi então removido in vacuo usando um evaporador rotativo.O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna flash (gel de sílica, CH2Cl2:MeOH = 20:1) para obter RuDA como um pó verde (rendimento: 877,5 mg, 80%).ânus.Calculado para C64H48Cl2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Encontrado: C 67,92, H 4,26, N 9,82.1H NMR (600 MHz, d6-DMSO) δ 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13c nmr (150 MHZ, D6-DMSO), δ (PPM) 158.03, 152.81, 149.31, 147.98, 147.16, 139.98, 136.21, 135.57, 134.68, 130.34, 130.02, 128.68, 128.01, 125.51, 124.45, 120.81, 103.49, 103.49 , 103. , 86,52, 84,75, 63,29, 30,90, 22,29, 18,83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Síntese de 4,7-bis[4-(N,N-dietilamino)fenil-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol (L2): L2 foi sintetizado em duas etapas.Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) foi adicionado a solução de N,N-dietil-4-(tributilstanil)anilina (1,05 g, 2,4 mmol) e 4,7-dibromo-5,6-dinitro - 2, 1,3-benzotiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) em tolueno seco (100 ml).A mistura foi agitada a 100°C durante 24 horas.Após remoção do tolueno in vacuo, o sólido resultante foi lavado com éter de petróleo.Em seguida, uma mistura deste composto (234,0 mg, 0,45 mmol) e pó de ferro (0,30 g, 5,4 mmol) em ácido acético (20 ml) foi agitada a 80°C durante 4 horas.A mistura reaccional foi vertida em água e o sólido castanho resultante foi recolhido por filtração.O produto foi purificado duas vezes por sublimação a vácuo para dar um sólido verde (126,2 mg, 57% de rendimento).ânus.Calculado para C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Encontrado: C 67,84, H 6,95, H 18,16.1H NMR (600 MHz, CDCl3), δ (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13С NMR (150 MHz, CDCl3), δ (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Os compostos foram preparados e purificados seguindo procedimentos semelhantes ao RuDA.ânus.Calculado para C48H48Cl2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Encontrado: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81,1H NMR (600 MHz, d6-DMSO), δ (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13c nmr (151 mhz, CDCL3), δ (PPM) 158.20, 153.36, 148.82, 148.14, 138.59, 136.79, 135.75, 134.71, 130.44, 128.87, 128.35, 121.70, 111.84, 110.76, 105.07, 104.23, 87.0, 84.4., 38,06, 31,22, 29,69, 22,29, 19,19, 14,98, 12,93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA foi dissolvido em MeOH/H2O (5/95, v/v) a uma concentração de 10 μM.O espectro de absorção do RuDA foi medido a cada 5 minutos em espectrofotômetro Shimadzu UV-3600 sob irradiação com luz laser com comprimento de onda de 808 nm (0,5 W/cm2).Os espectros de ICG foram registrados nas mesmas condições do padrão.
Os espectros de EPR foram registrados em um espectrômetro Bruker EMXmicro-6/1 com potência de micro-ondas de 20 mW, faixa de varredura de 100 G e modulação de campo de 1 G. 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidona (TEMP) e 5,5-dimetil-1-pirrolina N-óxido (DMPO) foram usados ​​como armadilhas de rotação.Espectros de ressonância de spin eletrônico foram registrados para soluções mistas de RuDA (50 µM) e TEMF (20 mM) ou DMPO (20 mM) sob a ação de radiação laser com comprimento de onda de 808 nm (0,5 W/cm2).
Os cálculos de DFT e TD-DFT para RuDA foram realizados em níveis de PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ em solução aquosa usando o programa Gaussiano 1666,67,68.As distribuições HOMO-LUMO, buracos e elétrons do estado excitado singleto de baixa energia RuDA foram plotadas usando o programa GaussView (versão 5.0).
Primeiro tentamos medir a eficiência de geração de 1O2 RuDA usando espectroscopia UV-visível convencional com ICG (ΦΔ = 0,002) como padrão, mas a fotodegradação do ICG afetou fortemente os resultados.Assim, o rendimento quântico de 1O2 RuDA foi medido detectando uma mudança na intensidade da fluorescência do ABDA em cerca de 428 nm quando irradiado com um laser com comprimento de onda de 808 nm (0,5 W/cm2).Experimentos foram realizados em RuDA e RuDA NPs (20 μM) em água/DMF (98/2, v/v) contendo ABDA (50 μM).O rendimento quântico de 1O2 foi calculado usando a seguinte fórmula: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS e rICG são as taxas de reação de ABDA com 1O2 obtidas do fotossensibilizador e ICG, respectivamente.APS e AICG são a absorbância do fotossensibilizador e ICG a 808 nm, respectivamente.
As medições de AFM foram realizadas em condições líquidas usando o modo de varredura em um sistema Bruker Dimension Icon AFM.Usando uma estrutura aberta com células líquidas, as células foram lavadas duas vezes com etanol e secas com uma corrente de nitrogênio.Insira as células secas na cabeça óptica do microscópio.Coloque imediatamente uma gota da amostra na piscina de líquido e coloque-a no cantilever usando uma seringa de plástico descartável estéril e uma agulha estéril.Outra gota é colocada diretamente sobre a amostra e, quando a cabeça óptica é abaixada, as duas gotas se fundem, formando um menisco entre a amostra e o reservatório de líquido.As medições de AFM foram realizadas usando um cantilever de nitreto SCANASYST-FLUID em forma de V (Bruker, dureza k = 0,7 N m-1, f0 = 120–180 kHz).
Os cromatogramas de HPLC foram obtidos em um sistema Waters e2695 equipado com uma coluna phoenix C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) usando um detector 2489 UV/Vis.O comprimento de onda do detector é de 650 nm.As fases móveis A e B eram água e metanol, respectivamente, e a vazão da fase móvel era de 1,0 ml·min-1.O gradiente (solvente B) foi o seguinte: 100% de 0 a 4 minutos, 100% a 50% de 5 a 30 minutos e reajustado para 100% de 31 a 40 minutos.O minério foi dissolvido em uma solução mista de metanol e água (50/50, em volume) a uma concentração de 50 μM.O volume de injeção foi de 20 μl.
Os ensaios GPC foram registrados em um instrumento Thermo ULTIMATE 3000 equipado com duas colunas PL aquagel-OH MIXED-H (2×300×7,5 mm, 8 µm) e um detector de índice de refração ERC RefratoMax520.A coluna GPC foi eluída com água a um caudal de 1 ml/min a 30°C.NPs de minério foram dissolvidos em solução de PBS (pH = 7,4, 50 μM), o volume de injeção foi de 20 μL.
As fotocorrentes foram medidas em uma configuração eletroquímica (CHI-660B, China).As respostas optoeletrônicas quando o laser foi ligado e desligado (808 nm, 0,5 W/cm2) foram medidas a uma voltagem de 0,5 V em uma caixa preta, respectivamente.Uma célula padrão de três eletrodos foi usada com um eletrodo de carbono vítreo em forma de L (GCE) como eletrodo de trabalho, um eletrodo de calomelano padrão (SCE) como eletrodo de referência e um disco de platina como contra-eletrodo.Uma solução de Na2SO4 0,1 M foi usada como eletrólito.
A linha celular de câncer de mama humano MDA-MB-231 foi adquirida da KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, China, número de catálogo: KG033).As células foram cultivadas em monocamadas em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, glicose alta) suplementado com uma solução de soro fetal bovino a 10% (FBS), penicilina (100 μg/ml) e estreptomicina (100 μg/ml).Todas as células foram cultivadas a 37°C em uma atmosfera úmida contendo 5% de CO2.
O ensaio MTT foi utilizado para determinar a citotoxicidade de RuDA e RuDA-NPs na presença e ausência de irradiação de luz, com ou sem Vc (0,5 mM).As células cancerosas MDA-MB-231 foram cultivadas em placas de 96 poços a uma densidade celular de aproximadamente 1 x 105 células/ml/poço e incubadas por 12 horas a 37,0°C em uma atmosfera de 5% de CO2 e 95% de ar.As NPs RuDA e RuDA dissolvidas em água foram adicionadas às células.Após 12 horas de incubação, as células foram expostas à radiação laser de 0,5 W cm -2 no comprimento de onda de 808 nm por 10 minutos (300 J cm -2) e depois incubadas no escuro por 24 horas.As células foram então incubadas com MTT (5 mg/ml) por mais 5 horas.Finalmente, mude o meio para DMSO (200 µl) para dissolver os cristais de formazan roxo resultantes.Os valores de OD foram medidos usando um leitor de microplacas com comprimento de onda de 570/630 nm.O valor de IC50 para cada amostra foi calculado usando o software SPSS a partir de curvas de dose-resposta obtidas de pelo menos três experimentos independentes.
As células MDA-MB-231 foram tratadas com RuDA e RuDA-NP a uma concentração de 50 μM.Após 12 horas de incubação, as células foram irradiadas com laser com comprimento de onda de 808 nm e potência de 0,5 W/cm2 por 10 min (300 J/cm2).No grupo vitamina C (Vc), as células foram tratadas com 0,5 mM Vc antes da irradiação com laser.As células foram então incubadas no escuro por mais 24 horas, depois coradas com calceína AM e iodeto de propídio (20 μg/ml, 5 μl) por 30 minutos, depois lavadas com PBS (10 μl, pH 7,4).imagens de células coradas.