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As células cancerosas desenvolveram vários mecanismos para superar o estresse celular e continuar a progredir.A proteína quinase R (PKR) e seu ativador de proteína (PACT) são os respondedores iniciais que monitoram vários sinais de estresse que levam à inibição da proliferação celular e apoptose.No entanto, a regulação da via PACT-PKR em células cancerosas permanece em grande parte desconhecida.Aqui, descobrimos que o RNA não codificante longo (lncRNA) aspartil tRNA sintetase RNA 1 antisense (DARS-AS1) está diretamente envolvido na inibição da via PACT-PKR e promove a proliferação de células cancerígenas.Usando a triagem funcional em larga escala do lncRNA associado ao câncer CRISPRi 971, descobrimos que o DARS-AS1 estava associado a uma proliferação de células cancerígenas significativamente aumentada.Portanto, o knockout DARS-AS1 inibe a proliferação celular e promove a apoptose de células cancerígenas em várias linhagens de células cancerígenas in vitro e reduz significativamente o crescimento tumoral in vivo.Mecanicamente, DARS-AS1 liga-se diretamente ao domínio de ativação PACT e previne a interação PACT-PKR, reduzindo assim a ativação de PKR, fosforilação de eIF2α e inibindo a morte celular apoptótica.Clinicamente, DARS-AS1 é amplamente expresso em múltiplos cânceres, e a superexpressão deste lncRNA é indicativo de mau prognóstico.Este estudo elucida a regulação específica do câncer da via PACT-PKR pelo lncRNA DARS-AS1 e fornece outro alvo para o prognóstico e tratamento do câncer.
A capacidade de se adaptar ao estresse é uma característica importante da sobrevivência e proliferação de células cancerígenas.A rápida proliferação e as características metabólicas do câncer atingem o pico em microambientes agressivos – privação de nutrientes, hipóxia e baixo pH – que podem desencadear vias de sinalização de morte celular.A desregulação de genes sensíveis ao estresse, como p535, proteínas de choque térmico 6, 7, KRAS8, 9 e HIF-110, 11, 12, 13 é frequentemente observada no câncer, bloqueando a apoptose e promovendo a sobrevivência.
A proteína quinase R (PKR) é um importante sensor de estresse e subunidade quinase do fator de iniciação eucariótica 2α (eIF2α), um regulador translacional que liga o estresse celular à morte celular.A PKR foi originalmente identificada como uma proteína antiviral pela detecção de um RNA de fita dupla estranho (dsRNA).Após a ativação, a PKR fosforila eIF2α para inibir a síntese proteica viral e celular14,15,16.PACT (proteína ativadora de PKR) foi identificada como a primeira proteína ativadora de PKR na ausência de dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Através da interação direta com PKR, o PACT transduz vários estresses (inanição de soro, tratamento com peróxido ou arsenito) para PKR e vias de sinalização a jusante.Além da fosforilação de eIF2α, a ativação de PKR mediada por PACT desencadeia vários eventos associados à resposta ao estresse, incluindo status redox alterado pela via PI3K/Akt24, verificação aprimorada de danos ao DNA via p5325,26 e NF-κB27,28 Regula a transcrição, 29. Dado seu papel crítico na resposta ao estresse, proliferação, apoptose e outros processos celulares importantes, PKR e PACT são alvos terapêuticos promissores para muitas doenças, especialmente câncer30,31,32,33.No entanto, apesar deste significado funcional e biológico pleiotrópico, a regulação da atividade PACT/PKR em células cancerígenas permanece indefinida.
lncRNAs são transcritos maiores que 200 nucleotídeos sem potencial de codificação de proteínas.Desde que projetos de sequenciamento de genoma inteiro de ponta identificaram milhares de lncRNAs,35,36 muito esforço foi feito para elucidar suas funções biológicas.Um crescente corpo de pesquisa mostrou que os lncRNAs estão envolvidos em muitos processos biológicos37, incluindo a regulação da inativação do cromossomo X38,39, imprinting40, transcrição41,42, tradução43 e até mesmo o crescimento do câncer44,45,46,47.Esses estudos relataram que muitos lncRNAs estão envolvidos na via PACT/PKR.Um desses estudos mostrou que o lncRNA ASPACT inibiu a transcrição de PACT e aumentou a retenção nuclear de mRNA de PACT.Outros estudos mostraram que o lncRNA nc886 se liga à PKR e inibe sua fosforilação49,50.Até agora, lncRNA regulando a ativação de PKR mediada por PACT não foi relatada.
O RNA 1 antisense da aspartil-tRNA sintetase (DARS-AS1) foi identificado como um lncRNA oncogênico51,52,53,54.Através da regulação de miP-194-5p53, miP-12952 e miP-532-3p51, DARS-AS1 demonstrou promover o crescimento de carcinoma de células renais de células claras, carcinoma de tireóide e carcinoma de pulmão de células não pequenas, respectivamente.Tong e colegas também descobriram que o DARS-AS1 promove a progressão do mieloma, mantendo a estabilidade do motivo de ligação ao RNA da proteína 39 (RBM39).No entanto, nenhum estudo foi realizado sobre se este lncRNA está envolvido na regulação da ativação do PACT-PKR e na resposta ao estresse das células cancerígenas.
Aqui, realizamos uma tela de perda de função em larga escala usando o sistema CRISPRi e determinamos que o lncRNA DARS-AS1 promove a proliferação de vários tipos de células cancerígenas.Além disso, identificamos um mecanismo importante: DARS-AS1 liga-se diretamente ao PACT, inibe a ligação de PACT e PKR, previne a fosforilação de eIF2α, um substrato de PKR inferior e, finalmente, inibe a morte celular apoptótica.Em conclusão, nosso trabalho revela o lncRNA DARS-AS1 como um regulador da via PACT-PKR e um alvo potencial para o tratamento e prognóstico do câncer.
Extensos estudos de perfil genômico identificaram centenas de lncRNAs associados ao câncer.No entanto, sua função permanece em grande parte desconhecida56.Para identificar candidatos promissores de lncRNA envolvidos na progressão do câncer, realizamos uma tela de perda de função para proliferação reduzida na linhagem celular de câncer colorretal SW620 usando o sistema CRISPRi (Fig. 1a).A característica única das linhas celulares de câncer de cólon SW480 e SW620 é que elas são derivadas de tumores primários e secundários em um único paciente.Isso fornece uma comparação valiosa para estudar as alterações genéticas na progressão do câncer de cólon avançado.Portanto, analisamos os transcriptomas de linhagens celulares de câncer colorretal (SW480 e SW620) usando sequenciamento de RNA e coletamos alguns lncRNAs funcionais potenciais da literatura publicada.Com base nesses resultados, projetamos uma biblioteca de sgRNA agrupada contendo 7355 oligos de sgRNA visando 971 lncRNAs associados ao câncer e 500 oligos de sgRNA não direcionados para um controle negativo (Dados Suplementares 1).
Representação esquemática da triagem usando o sistema CRISPRi.b enriquecimento de sgRNA após triagem.A linha pontilhada horizontal representa log2 (mudança de dobra) = ±0,58.A linha pontilhada vertical indica valor de p = 0,05.Os pontos pretos representam sgRNA não alvo (designado como NC).Os pontos vermelhos são sgRNAs direcionados ao DARS-AS1.Os pontos azuis são sgRNAs direcionados a LINC00205, um lncRNA oncogênico descrito anteriormente.mudança de dobra = (leitura normalizada, dia 17)/(leitura normalizada, dia 0).c O knockdown do sgRNA DARS-AS1 inibiu o crescimento celular.As barras de erro representam ± desvio padrão dos três experimentos.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 teste t de Student bicaudal.d Expressão de DARS-AS1 em tumores (conjunto de dados TCGA).em Expressão de DARS-AS1 em amostras pareadas normais e tumorais de pacientes com BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP e COAD, respectivamente (conjunto de dados TCGA).Os valores de p foram obtidos usando o teste t de Student bicaudal pareado.
Após construir o plasmídeo e empacotar o lentivírus, transduzimos a linha celular de câncer colorretal dCas9-SW620 com a biblioteca acima em quatro experimentos de infecção independentes.A multiplicidade de infecção (MOI) para essas infecções foi de 0,1-0,3, indicando que cada célula só pode ser transfectada com um sgRNA.Após 18 dias de cultura in vitro, o perfil de enriquecimento de sgRNAs alvo diminuiu ou aumentou após a triagem, enquanto o número de oligonucleotídeos de controle não direcionados permaneceu relativamente inalterado em comparação com o perfil de pré-triagem, indicando que nosso alvo tem uma triagem altamente específica biblioteca.Arroz.1b e tabela complementar 1). LINC00205, que foi relatado anteriormente para promover câncer de pulmão e progressão do câncer de fígado58,59,60, foi rastreado (log2 (foldchange) < -0,58, valor p < 0,05), confirmando a confiabilidade desse rastreamento (Fig. 1b). LINC00205, que foi relatado anteriormente para promover câncer de pulmão e progressão do câncer de fígado58,59,60, foi rastreado (log2 (foldchange) < -0,58, valor p < 0,05), confirmando a confiabilidade desse rastreamento (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, anteriormente relatado para promover a progressão de câncer de pulmão e câncer de fígado58,59,60, foi excluído (log2 (mudança de vezes) <-0,58, valor p <0,05), confirmando a robustez desta triagem (Fig. .1b) . LINC00205 之前 报道 可 促进 肺癌 和 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 （（log2 （倍数 变化） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 证实 了 该 的 可靠性 可靠性 （图 图。。） ， ， 证实 了 该 的 可靠性 （（图 图。。） ， ， LINC00205 之前 报道 可 促进 肺癌 和 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 （（log2 （倍数 变化） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 证实 了 该 的 可靠性 可靠性 （图 图。。） ， ， 证实 了 该 的 可靠性 （（图 图。。） ， ， LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, previamente relatado para promover a progressão do câncer de pulmão e fígado58,59,60, foi excluído (log2 (mudança de vezes) <-0,58, valor p <0,05), confirmando a robustez desta triagem (Fig. .1b).
Entre todos os lncRNAs testados, o DARS-AS1 também foi rastreado, com os três oligonucleotídeos de sgRNA cognatos significativamente reduzidos após 18 dias de cultura, sugerindo que o knockdown deste lncRNA resultou na redução da proliferação do câncer (Fig. 1b).Este resultado foi ainda apoiado pela análise MTS em células de câncer colorretal, mostrando que a taxa de crescimento de células knockdown DARS-AS1 foi reduzida pela metade em comparação com células de controle (Figura 1c) e foi consistente com relatórios anteriores de vários outros tipos de câncer.: câncer renal de células claras, câncer de tireoide e câncer de pulmão de células não pequenas51,52,53,55.No entanto, sua função e mecanismos moleculares no câncer colorretal permanecem inexplorados.Portanto, escolhemos este lncRNA para um estudo mais aprofundado.
Para estudar a expressão de DARS-AS1 em pacientes, analisamos de forma abrangente 10.327 amostras de tumor do projeto Cancer Genome Atlas (TCGA).Nossos resultados mostram que DARS-AS1 é amplamente expresso e significativamente suprarregulado em células saudáveis ​​em uma variedade de tumores, incluindo adenocarcinoma de cólon (COAD), carcinoma de células claras renais (KIRC) e carcinoma de células papilares renais (KIRP)..Muito poucos (Fig. 1d e Fig. Suplementar 1a, b). A análise de amostras saudáveis/tumorais pareadas confirmou ainda uma expressão significativamente maior de DARS-AS1 nos tumores de carcinoma urotelial da bexiga (BLCA), carcinoma renal de células claras (KIRC), adenocarcinoma da próstata (PRAD), carcinoma de células escamosas do pulmão (LUSC) , carcinoma endometrial de corpo uterino (UCEC), adenocarcinoma de pulmão (LUAD), carcinoma hepatocelular de fígado (LIHC), carcinoma de células papilares renais (KIRP) e adenocarcinoma de cólon (COAD) (valor de p < 0,05) (Fig. 1e-m) . A análise de amostras saudáveis/tumorais pareadas confirmou ainda uma expressão significativamente maior de DARS-AS1 nos tumores de carcinoma urotelial da bexiga (BLCA), carcinoma renal de células claras (KIRC), adenocarcinoma da próstata (PRAD), carcinoma de células escamosas do pulmão (LUSC) , carcinoma endometrial de corpo uterino (UCEC), adenocarcinoma de pulmão (LUAD), carcinoma hepatocelular de fígado (LIHC), carcinoma de células papilares renais (KIRP) e adenocarcinoma de cólon (COAD) (valor de p < 0,05) (Fig. 1e-m) .A análise de amostras saudáveis/tumorais pareadas também confirmou uma expressão significativamente maior de DARS-AS1 em tumores de carcinoma urotelial de bexiga (BLCA), carcinoma de células renais e de células renais (KIRC), adenocarcinoma de próstata (PRAD), carcinoma de células escamosas de pulmão (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , carcinoma endometrial do corpo uterino (UCEC), adenocarcinoma do pulmão (LUAD), carcinoma hepatocelular do fígado (LIHC), carcinoma de células papilares do rim (KIRP) e adenocarcinoma do cólon (COAD) (valor de p < 0,05) (Fig. 1e–m) .配对 健康/肿瘤样本 的 进一步 证实 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 皮癌 皮癌 (BLCA) 、 肾 肾 透明 (kirc) 、 腺腺癌 腺腺癌 (Prad) 、 细胞癌 细胞癌 (lusc) 肿瘤 的 的显着 更 表达 ， 子宫体子宫 内膜 （（ucec） ， （（Luad） ， 肝肝 （（lihc） ， 肾 肾 细胞癌 （（kirp） 和结肠腺癌 （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 证实 了 了 dars-os1 在 尿路 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (Prad) 、 细胞癌 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 ， ， 内膜 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （liHc） 肾 乳头状 乳头状 细胞 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .A análise de amostras pareadas saudáveis/tumor apoiou ainda mais o papel do DARS-AS1 no carcinoma urotelial da bexiga (BLCA), carcinoma de células renais de células claras (KIRC), adenocarcinoma da próstata (PRAD) e carcinoma de células escamosas do pulmão (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). expressão em carcinoma de corpo uterino (UCEC), adenocarcinoma de pulmão (LUAD), carcinoma hepatocelular (LIHC), carcinoma de células papilares renais (KIRP) e adenocarcinoma de cólon (COAD) (valor de p <0,05) (Figura 1e-m).Tomados em conjunto, esses resultados indicam que DARS-AS1 é amplamente e altamente expresso em uma variedade de cânceres.
Como o DARS-AS1 e o DARS (o gene que codifica a fita antisense) compartilham o mesmo promotor e estão localizados próximos um do outro, projetamos o shRNA para derrubar especificamente o DARS-AS1, mas não o DARS (Fig. 2a,b suplementar e Tabela 2 suplementar) .Além de SW620, também usamos três outras linhagens de células altamente expressando DARS-AS1 para estudar a eficácia e função do knockdown de shRNA (Tabela Suplementar 3).Nossos resultados indicaram que todos os três shRNAs desenvolvidos alcançaram pelo menos 80% de eficiência de knockdown de DARS-AS1 com pouco efeito sobre a quantidade de mRNA de DARS (Fig. 2c-f suplementar).Além disso, descobrimos que o knockdown de DARS-AS1 com esses shRNAs inibiu significativamente o crescimento celular nas linhagens de células de câncer colorretal SW620 (49,7%) e HCT116 (27,7%), linhagem de células de câncer de mama MBA-MD-231 (53,4%).) e a linhagem celular de hepatoma HepG2 (redução de 92,7%), bem como sua capacidade de formar esferas não ancoradas (redução média de ~ 50,8%, 44,6%, 40,7% e 75,7% por linha celular) (Fig. 2a,b).Em SW620, os resultados do ensaio de formação de colônias confirmaram ainda que o shRNA DARS-AS1 inibiu significativamente a proliferação celular com uma diminuição média de aproximadamente 69,6% (Fig. 2c).
Efeito do shRNA de controle e shRNA DARS-AS1 na proliferação celular (a) e formação de esferoides (b) em células SW620, HCT116, MBA-MD-231 e HepG2.c Efeito de shRNA de controle e shRNA DARS-AS1 na formação de colônias em células SW620.Proliferação celular (d), formação de esferoides (e) e formação de colônias (f) de células SW620 superexpressando DARS-AS1.Os dados apresentados são a média ± desvio padrão de três experiências.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 e *** p ≤ 0,001 pelo teste t de Student bicaudal.
Para complementar os estudos de perda de função, criamos células SW620 superexpressando DARS-AS1 (Fig. 2g complementar).A superexpressão de DARS-AS1 aumentou significativamente o crescimento celular (1,8 vezes), a formação de esferóides não ancorados (1,4 vezes) e a formação de colônias (3,3 vezes) em células SW620 (Fig. 2d-f).Confirmamos este resultado usando outra linha celular expressando DARS-AS1, A549.Esta proliferação celular aumentada devido à superexpressão de DARS-AS1 foi ainda observada em células A549 (Fig. Suplementar 2h, ie Tabela Suplementar 3).Juntos, esses estudos de ganho e perda demonstram que o DARS-AS1 promove a proliferação de células cancerígenas in vitro.
Para explorar o mecanismo subjacente pelo qual o DARS-AS1 regula a proliferação celular, realizamos uma análise de pull-down de RNA para identificar seus potenciais parceiros de ligação a proteínas.Os resultados de RT-qPCR mostraram que cerca de 86,2% do DARS-AS1 está localizado no citoplasma das células SW620 (Fig. 3a complementar).O DARS-AS1 biotinilado ou pseudoRNA transcrito in vitro foi então incubado com lisados ​​de células SW620 seguido por separação SDS-PAGE.A coloração de prata subsequente mostrou que uma banda distinta (~ 38 kDa) foi significativamente enriquecida em amostras de tração de DARS-AS1, mas não em amostras de RNA ou esferas fictícias (Fig. 3a).Esta banda foi identificada como uma proteína ativadora de PKR (PACT) por espectrometria de massa (MS) e posteriormente confirmada por immunoblotting em linhas celulares SW620, HCT116 e HepG2 (Fig. 3a,b).O enriquecimento de DARS e proteínas PACT relacionadas – PKR e TRBP – também foi investigado usando análise de RNA por Western blotting (WB).Os resultados indicaram que nenhuma interação direta entre o RNA DARS-AS1 e essas três proteínas foi encontrada (Fig. 3b suplementar).A interação específica entre DARS-AS1 e PACT foi ainda confirmada por análise de imunoprecipitação de RNA (RIP), que mostrou que DARS-AS1 foi significativamente enriquecido em anticorpos anti-PACT, mas não em outros RNAs de controle (Figura 3c).Para determinar se DARS-AS1 interage diretamente com PACT na ausência de quaisquer outros componentes celulares, um ensaio de interferometria de biocamada in vitro (BLI) foi realizado usando PACT purificado.O DARS-AS1 marcado com biotina ou RNA fictício foi imobilizado em biossensores de estreptavidina (SA) e depois incubado em tampão cinético contendo 1 μM de PACT.Notavelmente, PACT se ligou fortemente a DARS-AS1 (valor KD ~ 26,9 nM), mas não para mimetizar RNA (Figura 3d).Em conjunto, esses resultados demonstram uma interação direta e alta afinidade entre DARS-AS1 e PACT.
A análise de RNA pull identificou DARS-AS1 interagindo com PACT em células SW620.Acima, coloração com prata de proteínas relacionadas.Os immunoblots inferiores foram realizados com anticorpo anti-PACT.b A análise pull-down de RNA foi realizada em células HCT116 (superior) e HepG2 (inferior).O enriquecimento PACT foi detectado por immunoblotting.Os ensaios de imunoprecipitação de cRNA (RIP) foram realizados em células SW620 usando os anticorpos indicados.d Curvas de ligação de PACT para DARS-AS1 de comprimento total ou RNA de controle foram obtidas usando interferometria de biocamada (BLI).O RNA foi imobilizado em um biossensor de estreptavidina.1 μM PACT foi usado para medir a associação.O ensaio de RNA pull foi realizado usando DARS-AS1 de comprimento total biotinilado ou truncado (topo).Immunoblot mostrando PACT recebido (abaixo).f O PACT sinalizado purificado foi incubado com DARS-AS1 completo biotinilado ou truncado (como em e) para ensaio RIP in vitro.O RNA extraído foi verificado por RT-qPCR.g A afinidade relativa de diferentes fragmentos de RNA para PACT foi obtida usando interferometria de biocamada.Para análise, foram utilizados 100 nM de RNA e 1 μM de RAST.h Os ensaios RIP in vitro foram realizados usando PACT marcado intacto ou truncado purificado.O RNA extraído foi verificado por RT-qPCR.i Taxa de crescimento de células SW620 superexpressando DARS-AS1, PACT ou ambos.j A superexpressão de DARS-AS1 de comprimento total ou truncado em células SW620 teve efeitos diferentes no crescimento celular.k A apoptose foi detectada por immunoblotting com anticorpo anti-PARP.l Knockout de DARS-AS1 induz apoptose de células SW620 como mostrado por citometria de fluxo.Os dados apresentados são a média ± desvio padrão de três experiências. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, pelo teste t de Student bicaudal. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, pelo teste t de Student bicaudal. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 pelo teste t de Student bicaudal. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 pelo teste t de Student bicaudal.
Em seguida, geramos três fragmentos de RNA DARS-AS1 biotinilados por transcrição in vitro para identificar a região DARS-AS1 necessária para a associação PACT (Figura 3e).Os resultados da análise de RNA mostraram que cada fragmento foi capaz de interagir com PACT, mas a região 3'-terminal (384-768 nucleotídeos rotulados A3) mostrou mais de 1-384 nucleotídeos rotulados A1) (Fig. 3e).Resultados semelhantes foram observados no ensaio RIP in vitro usando PACT recombinante (Figura 3f).Consistente com esses resultados, experimentos para ligar fragmentos de RNA imobilizados ao PACT usando BLI também mostraram que o PACT tem uma afinidade maior para A3 (384-768 nt) (valor KD de aproximadamente 94,6 nM), enquanto quase não há ligações com outras áreas.(Fig. 3d).
Também examinamos as regiões de ligação associadas no PACT.PACT contém três domínios funcionais, dois dos quais são domínios de ligação de RNA de fita dupla conservados (dsRBD) e um terceiro domínio (designado D3) que atua como um ativador de interações de proteínas.Para examinar a capacidade de ligação de lncRNA de cada domínio, projetamos três mutações que removeram cada um dos três domínios e realizamos um ensaio RIP in vitro.Nossos resultados mostraram que a deleção do terceiro domínio (D3) de PACT reduziu significativamente sua interação com DARS-AS1 (em 0,11 vezes em comparação com PACT intacto) em comparação com as outras duas mutações (Fig. 3h), foi demonstrado que a liberação de D3 interagiu com DARS.-AC1.Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que a interação entre DARS-AS1 e PACT pode ocorrer principalmente através da extremidade 3' de DARS-AS1 e do domínio D3 de PACT.
Observamos que DARS-AS1 não teve efeito na expressão de PACT e PACT não teve efeito em DARS-AS1 (Fig. 3c suplementar).Em seguida, examinamos o efeito do knockdown do PACT no crescimento celular.Em contraste com o DARS-AS1, as células relativas cresceram 1,5 a 3 vezes mais rápido quando o PACT foi derrubado (Fig. 3d suplementar).Os resultados do ensaio de formação de colônias indicaram que as células formaram colônias de 2-3 vezes após o tratamento de shRNA com PACT (Fig. 3e complementar).Para testar se DARS-AS1 regula a proliferação celular por meio de PACT, geramos células SW620 que superexpressam PACT, DARS-AS1 ou ambos.A superexpressão de PACT mostrou inibição significativa da proliferação celular (Figura 3i).Enquanto a superexpressão de DARS-AS1 per se promoveu significativamente a proliferação celular, não houve diferença significativa na taxa de crescimento de células que superexpressam DARS-AS1 e PACT.Esses resultados sugerem que o PACT pode neutralizar o aumento da proliferação causado pela superexpressão de DARS-AS1.
Uma vez que diferentes regiões de DARS-AS1 têm diferentes habilidades de ligação a PACT, investigamos sua influência relativa na proliferação celular por diferentes superexpressão de fragmentos de DARS-AS1.Comparado com os outros dois fragmentos, DARS-AS1 foi superexpresso na extremidade 3' (384-768 nt), a principal região relacionada ao PACT em DARS-AS1, que teve a maior capacidade de estimular a proliferação celular (Fig. 3j).Esses resultados indicam uma correlação positiva entre a capacidade de ligação e a função biológica de DARS-AS1.
PACT foi relatado como uma proteína pró-apoptótica19.Portanto, investigamos o efeito do DARS-AS1 na apoptose.Como esperado, o knockdown de DARS-AS1 aumentou significativamente a clivagem de PARP em células SW620 e aumentou a proporção de células positivas para anexina V em linhas celulares SW620, HCT116, HepG2 e MBA-MD-231 (Fig. 3k).3).3f-h), indicando que o efeito antiapoptótico de DARS-AS1 em células cancerosas é oposto à função indutora de apoptose de PACT.Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que o mecanismo da função oncogênica do DARS-AS1 pode ser através da inibição da função PACT.
Em seguida, exploramos as implicações funcionais da associação DARS-AS1-PACT.Foi relatado que o PACT ativa a PKR por meio de interação direta, que subsequentemente aumenta a fosforilação de eIF2α, causando deleção translacional e apoptose17.Primeiro, examinamos se DARS-AS1 afeta a localização celular de PACT e PKR.A microscopia de fluorescência confocal mostrou que PACT e PKR estavam altamente colocalizados em células SW620 com um coeficiente de correlação de Pearson médio de 0,72.Enquanto isso, a superexpressão de DARS-AS1 reduziu significativamente a co-localização de PACT e PKR (coeficiente médio de correlação de Pearson 0,61) (Figura 4a).Para investigar se DARS-AS1 poderia modular a interação PACT-PKR, realizamos um ensaio de co-imunoprecipitação (co-IP) com anticorpo anti-PACT em lisados ​​de células SW620.A PKR foi altamente enriquecida em anti-PACT em células de controle, enquanto a recuperação de PKR foi significativamente reduzida em lisados ​​de células que superexpressam DARS-AS1 (Fig. 4b).PACT e PKR marcados purificados foram usados ​​para ensaios de ligação a proteínas in vitro.Consequentemente, aqueles que forneceram DARS-AS1, mas nenhum RNA de controle, mostraram interação PACT-PKR suprimida (Figura 4c).Todos os resultados mostraram que o DARS-AS1 interrompeu a comunicação PACT e PKR.
a Co-localização de PACT e PKR em células de controle ou células que superexpressam DARS-AS1 foi observada usando microscopia de fluorescência confocal.Os núcleos foram corados com DAPI.Os resultados estatísticos foram obtidos a partir de 16 fotografias.b Co-imunoprecipitação (co-IP) usando anticorpo anti-PACT em lisados ​​celulares de células SW620 de controle ou células que superexpressam DARS-AS1.c PACT marcado, PKR purificado e transcrito in vitro com DARS-AS1 ou RNA simulado foram incubados para análise de ligação proteica in vitro.Anticorpos anti-bandeira foram usados ​​para imunoprecipitação.d Immunoblots com os anticorpos indicados foram realizados em células SW620 e HCT116 transfectadas com shRNA controle ou DARS-AS1-shRNA seguido de privação de soro.e Os níveis de expressão de DARS-AS1 alteraram a sensibilidade celular à tapsigargina.As células SW620 foram transfectadas com shRNA DARS-AS1, plasmídeo de superexpressão de DARS-AS1 ou plasmídeo de controle.As células foram tratadas com tapsigargina por 48 horas e a viabilidade celular foi determinada usando o reagente MTS.f O DARS-AS1 transcrito in vitro ou RNA fictício e PACT purificado foram usados ​​para ensaio de ativação in vitro e detecção de immunoblot.g Immunoblots usando esses anticorpos foram realizados em células SW620-ctrl (esquerda) ou células que superexpressam mutantes PKR (direita).Estas células foram então transfectadas com shRNA de controle ou DARS-AS1-shRNA seguido de inanição de soro.h A citometria de fluxo mostrou que a inativação da PKR mutante compensou a apoptose induzida por DARS-AS1 em células SW620.i Imunotransferências com os anticorpos indicados foram realizadas em células SW620 (esquerda) ou HCT116 (direita).As células transfectadas com shRNA de controle ou shRNA DARS-AS1 são privadas de soro e suplementadas com inibidor de PKR C16 100 nM ou DMSO.Barra de escala = 5 µm.Os dados apresentados são a média ± desvio padrão de três experiências.* p ≤ 0,05 teste t de Student bicaudal.
Acredita-se geralmente que uma vez que PACT interage com PKR17, a fosforilação de PKR em Thr451 pode ser induzida.Nossos resultados indicaram que o nível de fosforilação de PKR foi significativamente elevado em células knockdown DARS-AS1 após inanição de soro (Fig. 4d e Fig. 4a Suplementar).Assim, descobrimos que a fosforilação de eIF2α, o principal substrato de PKR, também foi significativamente aumentada por DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d e Fig. 4a Suplementar).A tapsigargina é um estressor do RE que faz com que o RE libere Ca2+.Foi relatado que o tratamento com tapsigargina induz a expressão e ativação de PACT, que interage e ativa a PKR, levando à apoptose pelo aumento da fosforilação de eIF2α 18,61 .Aqui, usamos a tapsigargina como um estimulador da via PACT/PKR para investigar se o DARS-AS1 pode ajudar as células a superar o estresse inibindo a via PACT/PKR.Observamos que o nível de expressão de DARS-AS1 correlacionou-se positivamente com a resistência celular à tapsigargina.As células SW620 que superexpressam DARS-AS1 sobreviveram melhor quando tratadas com tapsigargina, enquanto as células com knockdown de DARS-AS1 tornaram-se mais suscetíveis (Fig. 4e).Consistente com esses resultados, a superexpressão de DARS-AS1 reduziu a fosforilação de PKR induzida por tapsigargina (Fig. 4b suplementar).Em contraste, após o tratamento com tapsigargina, PKR e eIF2α foram fosforilados em maior extensão nas células knockdown DARS-AS1 em comparação com as células de controle (Fig. 4b suplementar).Curiosamente, a tapsigargina induziu a expressão de DARS-AS1 de uma maneira dependente da dose, o que pode indicar uma função anti-stress de DARS-AS1 (Fig. 4c suplementar).Além disso, realizamos ensaios de ativação in vitro para confirmar essas observações.Resumidamente, a PKR foi purificada a partir de lisados ​​celulares usando um anticorpo anti-PKR, depois incubada com PACT recombinante e DARS-AS1 transcrito in vitro.Após a reação enzimática, a fosfo-PKR foi detectada usando WB.Nossos resultados indicaram que a fosforilação de PKR foi significativamente inibida por DARS-AS1, mas não por RNA de controle (Figura 4f).Estes resultados in vitro e in vivo sugerem que DARS-AS1 inibe a ativação de PKR mediada por PACT.Ao mesmo tempo, também observamos uma diminuição na recuperação de PACT na presença de DARS-AS1 (Figura 4f).Este resultado é consistente com os resultados do ensaio de ligação à proteína in vitro (Figura 4c) e novamente ilustra a função de bloqueio de DARS-AS1 para associação PACT-PKR.
Ser246 e Ser287 no domínio D3 de PACT são necessários para ativação de PKR sob estresse celular.A substituição de dois resíduos de serina por alanina deu o mutante PACT (mutD), que ativou PKR na ausência de estresse, e a substituição por alanina (mutA) reverteu o protocolo.Como demonstramos a importância desse domínio em associação direta com DARS-AS1, geramos esses dois mutantes PACT para testar se esses resíduos também poderiam estar envolvidos na interação com DARS-AS1.Curiosamente, ambos os mutantes perderam a capacidade de se ligar a DARS-AS1 (Fig. 4d suplementar), sugerindo que a estrutura completa da proteína PACT pode ser necessária para uma interação eficiente com DARS-AS1.
Além disso, nossos resultados também sugerem que a inibição da proliferação celular induzida por DARS-AS1-shRNA pode ser parcialmente restaurada pela superexpressão de um mutante PACT negativo dominante (PACTmutA) ou um mutante PKR negativo dominante (PKRmut) (Fig. 4e complementar. e).A superexpressão de mutantes de PKR dominantes negativos reduziu a fosforilação de PKR induzida pelo knockdown de DARS-AS1, bem como a fosforilação de eIF2α em células privadas de soro (Fig. 4g).Mais importante, a proporção de células apoptóticas induzidas pelo knockdown de DARS-AS1 também foi reduzida em células que superexpressam PKRmut (Fig. 4h e Fig. 4g Suplementar).A inibição da atividade da PKR quinase também prejudica a função de DARS-AS1, pois os resultados mostraram que o knockdown de DARS-AS1 raramente desencadeou a fosforilação de PKR e eIF2α quando as células foram tratadas com um inibidor de C16 específico de PKR (Fig. 4i e Fig. 4h suplementar).).Em conjunto, nossos resultados sugerem que DARS-AS1 promove a proliferação celular, pelo menos em parte, inibindo a ativação de PKR mediada por PACT.
Para explorar ainda mais o papel do DARS-AS1 na tumorigênese, realizamos experimentos in vivo usando um modelo de xenoenxerto de camundongo. Os resultados mostram que o knockdown de DARS-AS1 diminuiu drasticamente o crescimento tumoral em camundongos (valor p < 0,0001) (Fig. 5a). Os resultados mostram que o knockdown de DARS-AS1 diminuiu drasticamente o crescimento tumoral em camundongos (valor p < 0,0001) (Fig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Os resultados mostram que o knockdown de DARS-AS1 reduz drasticamente o crescimento tumoral em camundongos (valor de p < 0,0001) (Figura 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (р <0,0001). Os resultados mostraram que o knockdown de DARS-AS1 reduziu significativamente o crescimento tumoral em camundongos (valor de p < 0,0001) (Figura 5a).Assim, no grupo knockdown de DARS-AS1, houve uma diminuição significativa no volume médio do tumor em cerca de 72,9% e na massa tumoral média em cerca de 87,8% (Figura 5b-d).Esses resultados sugerem fortemente que o DARS-AS1 pode promover significativamente o crescimento do tumor in vivo.
Efeitos do knockdown ad DARS-AS1 na oncogênese colorretal em camundongos nude.Curvas de crescimento (a), tamanho do tumor (b), peso (c) e imagens do tumor (d) são mostradas.As barras de erro representam ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, pelo teste t de Student bicaudal. n = 10. ****p < 0,0001, pelo teste t de Student bicaudal. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 teste t de Student bicaudal.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 teste t de Student bicaudal.e Kaplan-Meier analisou a correlação entre os níveis de expressão de DARS-AS1 e a sobrevida global em pacientes com UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM e LGG.Altos níveis de expressão de DARS-AS1 em pacientes estavam entre os 50% superiores;o baixo nível de expressão de DARS-AS1 em pacientes estava nos 50% inferiores.Os valores de p foram determinados usando o teste de log rank.f Modelo proposto no qual o DARS-AS1 regula a via PACT-PKR e o crescimento tumoral.
Para entender melhor o impacto clínico do DARS-AS1, examinamos a correlação entre sua expressão e a sobrevida do paciente.Ao analisar o conjunto de dados do TCGA, descobrimos que a maior expressão de DARS-AS1 estava associada a melanoma uveal (UVM), cromofobia renal (KICH), carcinoma de células papilares renais (KIRP), mesotelioma (MESO), multiplex.A sobrevida inferior foi significativamente associada à morfose do glioblastoma (GBM) e pacientes com glioma cerebral de baixo grau (LGG) (Figura 5e).Esses resultados sugerem que o DARS-AS1 pode desempenhar um papel importante na progressão clínica do tumor e pode ser um potencial biomarcador preditivo em vários cânceres.
Neste estudo, usando a triagem funcional CRISPRi em larga escala, determinamos que o lncRNA DARS-AS1 supera o estresse das células cancerígenas regulando dois principais respondedores ao estresse, PACT e PKR.Ao interagir diretamente com PACT, DARS-AS1 inibiu a ativação de PKR mediada por PACT, prevenindo assim a morte celular apoptótica e promovendo a proliferação celular (Fig. 5f).A regulação positiva de DARS-AS1 foi observada em vários tipos de câncer, sugerindo que sua função de promover a sobrevivência de células cancerígenas sob condições estressantes pode ser amplamente aplicável a vários tipos de câncer.
PACT foi identificado como uma proteína ativadora de PKR, e a ativação de PKR mediada por PACT desempenha um papel importante nas respostas ao estresse regulando a transcrição, tradução, apoptose e outros processos celulares importantes62.Durante décadas, foram feitas tentativas para entender a regulação específica do câncer da cascata PACT-PKR.Aqui, nosso estudo revelou um mecanismo diferente de regulação do PACT-PKR em células cancerosas através do lncRNA celular DARS-AS1, que se liga diretamente ao PACT, bloqueia a interação PACT-PKR, inibe a ativação de PKR e a fosforilação de eIF2α, inibindo assim a apoptose induzida por estresse e estimulando eventual proliferação do câncer.células.Esta descoberta lança luz sobre potenciais alvos de lncRNA para o prognóstico e terapia do câncer.
Nossos dados mostraram que o knockdown de DARS-AS1 sensibiliza as células à inanição de soro com um aumento significativo na PKR fosforilada e eIF2α.Esses resultados sugerem que o DARS-AS1 promove a sobrevivência de células cancerígenas sob condições adversas, inibindo a atividade de PACT/PKR.Vários outros RNAs não codificantes, como ASPACT e nc886, também estão envolvidos no eixo PACT/PKR, regulando negativamente o mRNA de PACT48 ou regulando a autofosforilação por ligação a PKR49,50,64.Entre eles, o DARS-AS1 atua como um disruptor da associação PACT-PKR.Este estudo enriquece nossa compreensão da regulação do eixo PACT/PKR e o papel dos lncRNAs nas respostas ao estresse.
O PACT contém três domínios separados.Cada um dos dois primeiros dsRBDs é suficiente para atingir a ligação de alta afinidade de PACT a PKR, enquanto o terceiro domínio (D3) é necessário para ativação de PKR in vitro e in vivo.Nosso estudo mostrou que DARS-AS1 interage preferencialmente com o domínio D3 (Fig. 3h).Dado o grande tamanho do lncRNA (768 nucleotídeos), a ligação de DARS-AS1 a D3 pode inibir fisicamente a interação entre o domínio PACT de dsRBD e PKR, bloqueando assim a associação de PACT e PKR.Mutações pontuais PACT que substituíram Ser246 e Ser287 em D3 por alanina ou aspartato interromperam sua afinidade de ligação para DARS-AS1, apontando para a importância das propriedades estruturais e elétricas gerais de D3 em sua associação.Mais detalhes desse mecanismo serão necessários no futuro, usando análises bioquímicas mais precisas e análise estrutural PACT de alta resolução.
Estudos anteriores relataram que o DARS-AS1 promove a proliferação celular por meio de vários mecanismos51,52,53.Em um exemplo, os pesquisadores observaram que o DARS-AS1 regulou positivamente seu gene DARS que codifica a proteína antisense ao direcionar o miP-194-5p em células cancerígenas do rim.No entanto, no presente estudo, o knockdown de DARS-AS1 teve pouco efeito na transcrição de DARS em vários tipos de câncer, incluindo pelo menos câncer colorretal, de mama e de fígado.Como os lncRNAs exibem padrões de expressão específicos de células e tecidos, os mecanismos funcionais podem não ser conservados entre os tipos de câncer, o que pode contribuir para essa discrepância entre nossas observações e avaliações anteriores de diferentes tipos de câncer.Estudos especiais são necessários para elucidar os mecanismos específicos de vários processos fisiológicos e patológicos.
Uma análise de dados clínicos mostrou que a expressão de DARS-AS1 em tumores está inversamente correlacionada com a sobrevida de pacientes com câncer, o que ressalta a importância do eixo DARS-AS1/PACT/PKR no prognóstico do câncer.Em conclusão, nosso estudo mostra que o DARS-AS1 é um regulador do eixo de sinalização PACT/PKR, promove a proliferação de células cancerígenas e inibe a apoptose durante a resposta ao estresse, o que fornece outra linha de pesquisa e é de interesse para futuras pesquisas sobre possíveis tratamentos .
As linhas de células humanas SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 e HEK293T foram obtidas da National Cell Line Resource Infrastructure na China.Todas as células foram mantidas em meio DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) suplementado com 10% de FBS (Gemini, Brooklyn, NY) e 1% de penicilina-estreptomicina (Thermo Fisher Scientific) a 37°C, 5% de CO2.incubadora.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fósforo S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fósforo S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulina, CST (2128);IgG de camundongo normal, CST (5415S);IgG de coelho normal, CST (2729S).Os anticorpos foram diluídos 1:1000 em PBST para Western blotting e 1:100 para IP.
Os sgRNAs foram desenvolvidos usando uma ferramenta disponível publicamente chamada CRISPR-ERA66.Usamos os parâmetros da ferramenta padrão para o desenvolvimento de sgRNA e o algoritmo calculou os locais de ligação de sgRNA na região de 3 kb.centrado em TSS.Pools de oligonucleotídeos de sgRNA foram sintetizados em CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) e clonados em plasmídeos de pgRNA humanizados (Addgene #44248).Um total de 12 µg de plasmídeo pgRNA humanizado agrupado, 7,2 µg de psPAX2 (Addgene #12260) e 4,8 µg de pMD2.G (Addgene #12259) foram co-transfectados em 5 x 106 HEK293T em placas de 10 cm usando DNAfect Transfection Reagent células (CWBIO, Pequim, China) seguindo as instruções do fabricante.Os sobrenadantes contendo vírus foram coletados 48 e 72 horas após a transfecção e filtrados através de um filtro de 0,45 µm.Para triagem, as células SW620 que expressam a proteína de fusão dCas9/KRAB foram obtidas por transdução de vírus.As células SW620 modificadas foram infectadas com a biblioteca de vírus em quatro experimentos de infecção independentes em um MOI de 0,1-0,3 e foram amostradas com 2 μg/ml de puromicina (Sigma, St. Louis, MO) por 2 dias.Depois disso, as células foram cultivadas por 18 dias in vitro com uma cobertura mínima da biblioteca de 500 células/sgRNA para triagem.
O DNA genômico foi extraído de acordo com as instruções do QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Alemanha; 51183).No total, 100 μg de DNA genômico por repetição biológica foram usados ​​para construir a biblioteca.A região sgRNA foi amplificada por duas rodadas de PCR e ligada a um código de barras.
Os produtos de PCR foram purificados usando gel NucleoSpin® e kit de purificação de PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Alemanha; 740609.250) e quantificados usando o kit de detecção de DNA de fita dupla Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
O ensaio MTS foi usado para medir a proliferação celular.As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade inicial de 2000 células/poço.O número relativo de células foi medido diariamente no tempo indicado por um total de 4-6 dias.Para cada poço, 20 μl de reagente MTS (Promega) foram diluídos com 100 μl de DMEM, incubados com células por 4 h a 37°C e, em seguida, OD490 foi medido.
A capacidade de crescimento não ancorado foi descoberta analisando a formação de esferas.Resumidamente, 2.000 células transfectadas com shRNA DARS-AS1 ou shRNA controle foram cultivadas em microplacas de fixação ultra baixa (Corning) com troca de meio a cada 4 dias.Os esferóides foram contados após 14 dias.500 células transfectadas com o plasmídeo de superexpressão de DARS-AS1 ou um plasmídeo de controle foram usadas para o ensaio de aprimoramento, caso contrário, o método não foi alterado.
O RNA foi transcrito usando T7 RNA polimerase e biotina-16-UTP (Roche 1138908910) de acordo com as instruções de Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Os primers usados ​​aqui estão listados na Tabela Complementar 4.
As regiões PACT ou PKR codificadoras de proteínas foram clonadas em pET15b (Addgene #73619) e transformadas em BL21(DE3).As bactérias foram incubadas durante a noite em LB fornecido com ampicilina e depois diluídas 100 vezes com LB fresco.Quando a DO600 do meio atingiu 0,8, 1 mM de IPTG foi adicionado para induzir a expressão da proteína.Após incubação durante a noite com agitação suave (250 rpm a 20°C), o sedimento celular foi coletado por centrifugação (4000 rpm, 10 min, 4°C).Ressuspender o pellet de células em tampão de lise (50 mM de Tris, pH 8,0, 250 mM de NaCl, 1 mM de PMSF) e incubar em gelo por 30 min, depois sonicar (15 min, 5 s on/off, em gelo) e centrifugar (13.000 rpm)., 30 min, 4°C).O sobrenadante foi então carregado em resina Ni-NTA (QIAGEN) 3 vezes a 4°C, lavado 4 vezes com tampão de lavagem (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) e eluído 3 vezes, com um total de 10 ml de tampão eluente (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 250 mM, imidazol 300 mM).A proteína purificada foi determinada usando WB e a concentração foi determinada usando o kit de ensaio de proteína Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Os ensaios RIP foram realizados conforme descrito anteriormente, com modificações.Resumidamente, 1x tampão RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, inibidor de RNasin ribonuclease (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lisa coquetel citostático 1 x 107 (Roche, 1 mM DTT) e centrifugar a 13.000 rpm por 15 min a 4°C.O sobrenadante foi então incubado com esferas magnéticas de proteína A+G (Millipore) conjugadas com 5 μg de anticorpo anti-PACT (Abeam) ou IgG (CST).As esferas foram lavadas 5 vezes com tampão RIP 5x, depois digeridas com proteinase K (NEB).O RNA foi extraído com Trizol e determinado por RT-qPCR.Os primers são apresentados na Tabela Suplementar 5.
O ensaio RIP in vitro foi realizado de acordo com um protocolo de ensaio RIP padrão modificado.Um total de 5 pmol de ARN transcrito in vitro foi diluído 1x com tampão RIP e emparelhado por incubação a 65°C durante 5 minutos seguido de arrefecimento lento até à temperatura ambiente.Um total de 5 pmol de proteínas PACT marcadas com flag intactas ou mutadas foram purificadas a partir de E. coli.Incubar com RNA renaturado por 2 horas a 4°C e seguir o procedimento acima para análise RIP para IP anti-flag.
Para análise de extensão de RNA, células 1×107 foram lisadas com tampão 1xRIP.Após centrifugação a 13.000 rpm por 15 min a 4°C, o sobrenadante foi pré-tratado com 30 μl de esferas magnéticas de estreptavidina (Beckman) por 2 h a 4°C.O lisado purificado foi então fornecido com tRNA de levedura e incubado com 40 pmol de RNA renaturado durante a noite a 4 ° C, depois por mais 2 horas e 20 μl de novos grânulos magnéticos de estreptavidina bloqueados com BSA foram adicionados.A etapa de lavagem consistiu em 4 vezes com tampão RIP 5x e 4 vezes com tampão RIP 1x.As proteínas correspondentes foram eluídas com tampão de eluição de biotina (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotina, PMSF) e separadas em NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Após coloração com prata (Beyotime Biotechnology), certas bandas foram excisadas e analisadas por MS.
A análise Co-IP foi realizada para testar a interação entre PACT e PKR.Resumidamente, os lisados ​​sobrenadantes foram preparados incubando 1 x 107 células lisadas em 1 x tampão RIP seguido por centrifugação a 13.000 rpm por 15 minutos a 4°C.Os lisados ​​foram carregados com esferas magnéticas de proteína A + G, conjugados com 5 µg de anticorpo anti-PACT e girados suavemente durante a noite a 4°C.As esferas foram lavadas 3 vezes com tampão 5×RIP, duas vezes com tampão 1×RIP e eluídas com tampão 1×SDS.A proteína recuperada foi analisada por gel SDS-PAGE e detectada por WB.
Dois pmol de PACT sinalizado e 1 pmol de PKR foram purificados de E. coli.Diluir em tampão RIP 1× e incubar com 10 pmol de RNA renaturado por 2 horas a 4 ° C.Depois disso, eles foram incubados com anticorpo antimarcado conjugado com esferas magnéticas de proteína A+G por mais duas horas.As contas foram então lavadas quatro vezes com tampão RIP 1x e eluídas com tampão SDS 1x.O PACT e PKR resultantes foram detectados por WB.